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原理 步骤 SDS（蛋白质的分离） 蛋白质转移 蛋白质的免疫学检测 一、原 理 蛋白质样品经过SDS分离后，通过转移电泳或直接印迹方式原位转移至固相介质上，并保持原有的物质类型和生物学活性不变，然后应用抗原抗体反应进行特异性检测。 SDS依据：蛋白质分子量的差异 （1）SDS使蛋白质带有大量负电荷 （2） SDS、巯基乙醇作用下，结构松散，二硫键打开。 1、分离 （1）制胶 1%琼脂糖封底 装配电泳槽 灌注分离胶 灌注浓缩胶 （2）样品处理 （3）电泳 10%分离胶 ddH2O 5.9ml 30%丙烯酰胺 5.0ml 1.5mM Tris(PH8.8) 3.8ml 10%SDS 0.15ml 10%过硫酸铵 0.2ml TEMED 0.05ml 15ml 试剂原理 SDS, 巯基乙醇(2-ME)- 强还原剂. AP-化学聚合的催化剂. TEMED-加速剂. 以单体和双体丙烯酰胺为材料,在催化剂和加速剂作用下,聚合联接而形成的三维网状结构物质. 浓缩胶：主要是使样品在进入分离胶前被浓缩成很窄的圆盘状，从而提高了分离的分辨程度。 分离胶：被浓缩的盘状样品区带进入此胶内，根据各组分的分子量和电荷的不同而被分开。 免疫学检测 * Western blot 2、转移 3、免疫学检测 封闭过夜 一抗37°C 1h 洗3次 二抗37°C 1h 洗3次 底物显色5-15分钟 ddH2O洗涤 4、结果 5%浓缩胶 ddH2O 4.25ml 30%丙烯酰胺 0.65ml 1.0mM Tris(PH6.8) 0.1ml 10%过硫酸铵 0.005ml TEMED 0.0025ml 5ml SDS将洗净,干燥玻璃片嵌入塑胶凹槽中. 用经电极缓冲液配制的1%的琼脂糖 溶液将狭缝口封住(既不漏胶,又可作为盐桥)。 待琼脂糖凝固后,将玻板连同胶带凹槽安装在电泳模具上, 依次,用力均匀地拎紧螺栓。 配制分离胶, 依次混合各成分,一旦加入TEMED, 马上开始聚合,故应快速旋动混合物。 混匀后, 倒入玻片之间的空隙(注意不要产生气泡). 加至离顶部约3cm处, 用吸管覆加一层蒸馏水.(防止氧气抑制聚合及保持界面水平). 待20-30min后, 可看到出现界面, 表示已凝固。 配制浓缩胶, 离顶部约1cm时,即插入加样梳. 注意避免混入气泡. 约20-30min凝固。 将含有SDS, DTT的样品缓冲液与样品液(健康者血浆1:10) 1:1 混合后,沸水煮5-10min, 置于冰上(防止复性), 加样20?l/孔,最好在所有剩余的孔中加上等体积的1xSDS加样缓冲液。 电泳,下槽(+),上槽(-),100v, 4-5h。 凝胶 NC膜 蛋白质转移 凝胶电泳结束前30min, 将PVDF膜先浸泡在甲醇中,再浸泡在转移缓冲液中, 在转移模具上由下至上依次放入: 若干张3mm滤纸,PVDF膜,凝胶, 滤纸.注意逐层驱除气泡(用玻棒或移液管)。 连接电极: 膜(+), 凝胶(-)。 接通电源, 20-30v,45min。 转移电泳 Block: 1%BSA or 5%milk in TBS-T,overnight. Wash: PBS-Tween 3x5min. Ab Incubation: HRP 标记的羊抗人IgG，效价随实际情况调整, 也可用打点法决定最佳效价。370c, 1h。Wash 3x5min。 Develop: 加入底物溶液显色5~15min, 待出现棕色条带后, 用ddH2O反复洗涤，终止反应。 Results：阳性反应呈棕色条带。 * * * * *