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绿色荧光蛋白研究现状与应用 　　【摘 要】绿色荧光蛋白（GFP）最早发现于水母体中，是一种十分重要的蛋白质。由于其众多的优点，现已在分子生物和细胞生物的研究中应用十分广泛。随着技术的进步和研究的进一步深入，GFP基因也在许多其他方面将发挥着越来越重要的作用。 　　【关键词】绿色荧光蛋白；生色团；报告基因 　　2008年10月8日，瑞典皇家科学院诺贝尔奖委员会授予三位科学家：日裔美国科学家下村修(Osamu Shimomura)、美国科学家马丁?查尔非(Martin Chalfie)和美国华裔科学家钱永健(Roger Y．Tsien)诺贝尔化学奖，以表彰他们在绿色荧光蛋白(GFP)研究方面做出的突出贡献。 　　1 绿色荧光蛋白的理论研究 　　1.1绿色荧光蛋白的发现 　　绿色荧光蛋白最早于1962年在维多利亚多管发光水母体内被发现，同时它也存在于水螅和珊瑚等腔肠动物体内。它的内源基团可以在蓝光或紫外光激发下发射绿光，属于生物发光蛋白。绿色荧光蛋白在水母体内之所以能发光，主要依靠水母素的辅助。水母素和GFP之间能发生了能量转移，在钙的刺激下，其能量可转移到GFP，刺激GFP发光。 　　1.2绿色荧光蛋白的结构和发光原理 　　1992年Prasher等克隆了GFP基因的cDNA并分析了其一级结构。野生型GFP基因组全长2600bp，由3个外显子和2个内含子组成，编码238个氨基酸，分子量约28kDa。GFP的三维立体结构是由11个β折叠围在四周形成一个中空的圆柱体，1条α折叠贯穿在圆柱体的中间，其中有一段位于65-67位的3个氨基酸残基（Ser-Tyr-Gly）形成的杂环咪唑啉结构组成生色团，位于圆筒中央并附着在α螺旋上。绿色荧光蛋白的发光原理是位于氨基酸第65位的Ser的羧基和67位的Gly的酰基经过亲核反应生成咪唑基，66位的Tyr通过脱氢使芳香团与咪唑基结合，形成对羟基苯甲酸咪唑环酮生色团发出荧光。GFP的最大和次大的激发波长分别是395nm和475nm。溶液中，395nm激发的荧光发射峰在508nm，375nm激发的荧光发射峰在503nm。 　　1.3绿色荧光蛋白的优点 　　绿色荧光蛋白的独特之处即它的优点很多，主要有：荧光反应不需要底物和任何其他辅助因子，只需要在蓝光和紫外光下照射，利用荧光显微镜甚至是直接用肉眼就可以观察，易于检测且灵敏度???；荧光性质稳定，对光漂白有较强的耐受性；无毒害，转化后细胞仍可连续传代；通用性好，无种属特异性；分子量小，易于构建载体；不受假阳性干扰，结果真实可靠；可进行活细胞定时定位观察；易于得到突变体。 　　2 绿色荧光蛋白的应用 　　1994年Chalfie等首次在大肠杆菌细胞和线虫中表达了GFP，开创了GFP应用研究的先河。也正是由于绿色荧光蛋白的许多优点，使得其应用十分广泛。 　　2.1作为报告基因 　　GFP通常用作报告基因，可用来检测转基因效率，把GFP基因连接到目的基因的启动子之后，通过测定GFP的荧光强度就可以对该基因的表达水平进行检测。GFP最显著的优势是荧光反应不需要底物和其他辅助因子。有利必有弊，它最大的缺点是没有放大功能，不能像酶分子一样将信号放大，所以一般需要启动子驱动GFP基因在细胞内可以足量表达。目前，此方法无论在农杆菌介导或基因枪介导的植物遗传转化中还是在活细胞、转基因胚胎和动物中都已得到非常广泛的应用。 　　2.2作为融合标签 　　通过基因工程等生物学技术，GFP基因可以与外源基因融合构成嵌合基因。其表达产物既保持了外源蛋白的生物活性，又表现出与天然GFP相似的荧光特性。GFP的这种特性为蛋白质提供了一种荧光标记，不仅可以检测蛋白质分子的定位、迁移，还可以研究蛋白质分子的相互作用以及蛋白质构象变化，并依靠荧光共振能量转移来进行检测。 　　2.3其他 　　GFP还有其他重要应用：(1)研究基因表达的调控元件；(2)研究基因表达的时序控制与空间定位；(3)发育分子机理研究，GFP可以作为活体标记，在原位观察细胞的生长和运动。特别对于身体透明的动物观察起来更方便；(4)药物筛选，由于可以用不同颜色的GFP衍生物标记相关的蛋白来观察单细胞内相互作用的靶蛋白，再分离出目的细胞，从而可用于大规模药物筛选；(5)临床检验，生产出GFP标记的抗原或抗体，就可以免疫诊断；(6)转基因动物和植物的筛选标记，微生物在体内的感染途径，病毒和宿主的相互作用等，如将其插入动物、细菌或细胞的遗传信息中，随着细胞复制，可观察不断长大的癌症肿瘤、细菌的生长；(7)作为生物传感器，野生型和多种突变型GFP都有依赖pH的荧光变化，因而可以被用来检测活细胞内的pH等等。 　　3 绿色荧光蛋白的优化和改造 　　天然的GFP的荧光强度低，表达易受温度的影响，翻译合成后的蛋白质构象折叠的效率低，而且具