观赏植物DFR基因研究进展.doc

观赏植物DFR基因研究进展 　　摘要：从二氢黄酮醇4-还原酶基因结构、基因的进化、基因的表达特性及其在基因工程方面的研究进展进行了概述和总结。 　　关键词：DFR；基因结构；表达特性；基因进化；基因工程 　　中图分类号：S188 文献标识码：A DOI编码：10.3969/j.issn.1006－6500.2012.06.004 　　1 DFR基因在观赏植物的呈色及花色素苷合成途径中的作用 　　色彩是观赏植物表现出来的一个重要特性，花、叶、果实等这些观赏器官的颜色都决定着观赏植物的观赏价值和商业价值。在高等植物中，花色和果色主要由类黄酮、类胡萝卜素和甜菜色素三大色素所决定[1]。而类黄酮中的花色素苷则是影响花色的主要色素，赋予花和果实除绿色之外的其他颜色，如红色、粉红色、紫罗兰色和蓝色等，特定条件下还出现黑色[2]。 　　二氢黄酮醇4-还原酶(Dihydroflavonol 4-Reductase，DFR)在不同花色形成过程中发挥了关键作用，它是把二氢???酮醇转变为花色素反应的第一个酶[3]。类黄酮类色素的生物合成已经较为清楚[3-4](图1)。由苯丙氨酸到花青素的合成可以分为3个阶段:第一阶段由苯丙氨酸到香豆酰CoA,这是许多次生代谢都共有的;第二阶段是由香豆酰CoA到二氢黄酮醇,这是类黄酮代谢的关键反应,它合成花青素和其它黄酮物质；第三阶段是各种花色素苷的合成。 　　在花色素苷合成的途径中，DFR对花色素苷的最终形成起决定性作用。DFR是花色素苷生物合成中的关键性最初是在紫罗兰的一个突变体中发现的[5]。其反应需要NADPH参与。DFR依赖DHK、DHQ和DHM 3种底物，它们在结构上非常相似，只在B苯环上的轻基数目上不同。DFR能利用这3种底物，是因为F3′H和F3′5′H两种轻化酶的活性。F3′H能使DHK转化成DHQ。F3′5′H则可以让DHK转化为DHM，还可以使DHQ转化为DHM[6]。这是因为不同物种的DFR对底物选择性不同，合成了不同的花色素，就呈现出各异的花色[7]。就如矮牵牛的DFR缺乏还原底物DHK活性，所以其花瓣缺少橙色；而大丁草DFR能还原DHK，其花瓣就能产生橙色[8]。 　　2 二氢黄酮醇4-还原酶基因结构 　　1985年，O’Reiny C等[9]采用转座子标签技术，首次从玉米和金鱼草中分离出了DFR基因，1989年Beld等[10]用金鱼草DFR基因作为探针分离出了矮牵牛DFR基因，相关研究者陆续采用同源克隆的方法已在多观赏种植物中分离出了DFR基因（表1）。现有研究结果表明，DFR基因在植物的基因组中一般为单拷贝[5]，其为多基因家族的例子很少。裂叶牵牛（Ipomoeanil）与圆叶牵牛（I.purpurea）的基因组序列包含6个外显子和5个内含子，金鱼草、拟南芥与矮牵牛一样的DFR基因也包含了5个内含子；内含子的剪切位点均符合GT－AG法则[11]。陈大志等[12]在研究唇形亚纲植物DFR基因时表明，DFR表现为亲水性。唇形亚纲植物DFR基因的空间结构分为两个部分为松散C-末端和致密球状结构。DFR与NADPH辅助因子的底物结合区域都在致密球状结构中。唇形亚纲植物DFR都含有一个NADB_Rossmann superfamily保守结构域。 　　DFR为脱氢酶类，此类酶主要的特点是至少含有2个结构域即，第一个结构域—辅酶的结合位点及第二个结构域—催化作用位点。不同物种其DFR氨基酸序列存在一定区域的同源性，如在DFR与NADP结合位点，‘VTGAAGFIGSWLIMRLLERGY’，为高度保守区[13]。DFR对不同底物的结合由其分子中底物结合区氨基酸序列所决定的，这个序列在不同物种中也高度保守。结合区中134位与145位的氨基酸残基就直接影响酶的底物特异性，且大多数物种在134位含天冬氨酸残基(D)或是天冬酞胺残基(N)[14]。在矮牵牛以外的其他以DHK为底物的双子叶植物中，就存在高度保守的145位谷氨酸残基(E) [2]。祝婷等[15]利用DNAMAN软件对苦荞FtDFR和甜荞FeDFR推导的氨基酸序列及同源蛋白进行多序列比对，其发现在DFR蛋白质序列中有一个NADP(H)结合保守区域VTGASGFVGSWLVMRLLEHGY，且存在一个底物特异性结合的保守区域TVNVEEKQKPVYDETCWSDVDFCRRV。 　　3 二氢黄酮醇4-还原酶基因进化 　　DFR依照第134位氨基酸残基的不同将其可分为3类[16]：第一类为Asn型DFR，在绝大多种植物DFR中第134位氨基酸残基为天冬酰胺残基(N);第二类为Asp型DFR，其在134位上存在一个天冬氨酸残基(D)，此类DFR不能有效地将DHK还原成无色花葵素，如矮牵牛、番茄和三花龙胆;第三类是DFR的第134位氨基酸残基既