间充质干细胞的分离及其类髓核细胞分化导向.docVIP

间充质干细胞的分离及其类髓核细胞分化导向 　　间充质干细胞（mesenchymalstemcells,MSCs）是来源于中胚层的未分化的发育早期细胞，具有较强的增殖能力和多向分化能力。在特定的内环境和一定的细胞因子的诱导作用下，其可定向分化为多种组织细胞，如成骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞、心肌细胞、肝细胞、神经细胞、成纤维细胞等，正是由于其所具有的特性，使其成为了组织工程学中最常用的种子细胞。 　　由于骨髓间充质干细胞（bonemarrow mesenchymalstemcells, BMSCs）具有取材方便、体外培养简单、繁殖能力强、供体创伤小、不涉及伦理问题、良好的组织相容性、及其低抗原性所表现出的低免疫反应性等优点，使其成为了组织工程中经常使用的间充质干细胞。国内外均有使用一定的细胞因子诱导BMSCs增殖和分化为类软骨细胞及类髓核细胞的相关报道。本实验抽取新西兰兔的骨髓细胞，利用全骨髓贴壁法分离间充质干细胞，经过传代培养后再通过中胚层定向诱导分化的方法对所获取的细胞进行鉴定，确定其定向分化能力，再以转化生长因子 3（Transforming Growth Factor- 3,TGF- ）和骨形态发生蛋白 7（Bone Morphogenetic Protein -7,BMP-7）生长因子诱导其向类髓核细胞分化，为组织工程髓核的构建提供良好的种子细胞选择。 　　1 材料和方法 　　1.1 材料与试剂 　　DMEM-LG 培养基（Gibcol）、胎牛血清（Gibcol）、DMEM-HG 培养基（Gibcol）、成骨诱导培养基（地塞米松 10-9M，抗坏血酸钠 0.2mM，-甘油磷酸钠 10mM，5%FBS，DMEM-LG 培养基，1%双抗溶液）、成软骨诱导培养基（地塞米松 10-7M，抗坏血酸钠0.2mM，丙酮酸钠1mM，转化生长因子- 110ng/ml，ITS+LA，DMEM-HG 培养基，2%FBS，1%双抗溶液）、成脂肪诱导培养基（地塞米松 10-7M，吲哚美辛 0.05mM，IBMX0.5mM，2%FBS，DMEM-HG培养基，1%双抗溶液）、茜素红 S（Roche）、羊抗牛Ⅱ型胶原多克隆抗体（Southern Biotechno-logy）、番红 O（Sigma）、油红 O（Sigma）、TGF- 3（sigma）、BMP-7（sigma），CD29、CD105、CD166 均购自 eBioScience。新西兰兔购自上海生旺实验动物养殖有限公司。 　　1.2 兔 BMSCs 的分离培养 　　取2月龄的新西兰大白兔，雌雄不限，戊巴比妥溶液腹腔麻醉后，常规备皮，消毒，严格无菌操作，以骨髓穿刺针接10ml注射器（注射器内含稀释的肝素钠 3000U/0.2ml）自胫骨近端内侧处行骨髓穿刺术，抽取骨髓液 3ml，缓慢注入预置4ml淋巴细胞分层液的离心管内，进行密度梯度离心。2000rpm 离心 20 分钟后，吸取中间的单个核细胞层，弃去上清和脂肪，PBS（Phosphate Buffered Saline, 磷酸盐缓冲液）缓冲液冲洗 2次，再以 1.6×104/cm2的浓度接种于 100mm 培养皿内，加入15ml Ham’s F12 培养液（含青霉素钠 100U/ml，链霉素 100g/ml，两性霉素B 0.25 g/ml)，加入胎牛血清终浓度为 10%，置37℃、5%CO2、饱和湿度的条件下培养，于 48 小时后换液，以PBS 冲洗 3 遍，去除全部非贴壁细胞，换上新鲜培养基，同样环境中继续培养。以后每 3 日换液一次，待原代培养细胞爬满培养瓶底时，即可进行传代。用 0.25%的胰蛋白酶消化 5分钟后，即可得兔原代骨髓间充质干细胞悬液。 　　1.3 兔 BMSCs 表面抗原的鉴定 　　取生长汇合约 90%的第 3 代细胞，小心吸去培养液，加入 3ml0.25%胰蛋白酶/EDTA消化液，于 37℃消化约 3 分钟，加入含 10%FBS 的 DMEM 培养液 1ml 中止消化，PBS 冲洗两次，以 1000rpm离心 5 分钟，弃去上清，加入新鲜培养液制备成细胞悬液，并调整细胞浓度为 1×106/ml，取 100 l 细胞悬液置于流式管中，按照试剂说明加入抗体，充分混匀后室温避光放置 30 分钟，加入流式细胞仪缓冲液1ml混匀后 1000rpm离心 5 分钟，弃去上清，再加入 0.5ml流式细胞仪缓冲液重悬细胞后，以流式细胞仪进行检测。 　　1.4 兔 BMSCs 的诱导分化 　　1.4.1 向成骨细胞方向诱导分化 　　取基本铺满瓶底的第3代细胞，胰蛋白酶消化后以2×104/cm2的密度接种于 24 孔板中，加入成骨诱导培养液，每 3 天换液一次，培养 14 天后行茜素红 S 染色。 　　1.4.2 向成软骨细胞方向诱导分化