Q—开关激光对黄褐斑动物模型黑素细胞周期与凋亡影响.docVIP

Q—开关激光对黄褐斑动物模型黑素细胞周期与凋亡影响 　　[摘要]目的：探讨Q-开关 Nd：YAG激光不同能量照射黄褐斑动物模型对表皮黑素细胞周期与凋亡的影响。方法：用Q-开关激光不同能量照射黄褐斑动物模型，取表皮黑素细胞进行细胞培养，光学显微镜观察黑素细胞形态学变化，流式细胞仪检测照射后细胞周期与凋亡。结果：软件分析结果显示，除高能高频组外Q-开关Nd：YAG 1064nm 激光第一次照射后即刻各能量密度与频率组黑素细胞形态、细胞周期与凋亡无明显改变。第5次激光照射后即刻，高能高频、高能低频和低能高频组与照射前比较树突数量明显减少和长度明显缩短，S期细胞比率减少，凋亡率显著增加，差异有统计学意义（P0.01）。结论：当激光能量和频率达到一定阈值时能使黑素细胞体积变小、树突数量减少、长度缩短、S期细胞比率减少、凋亡率显著增加。为临床应用Q-开关1064nm Nd：YAG激光治疗色素性疾病提???了实验依据。 　　[关键词]激光；黑素细胞；细胞周期；细胞凋亡 　　[中图分类号]R758.4+2 [文献标识码]A [文章编号]1008-6455（2013）12-1286-05 　　通过Q-开关激光技术的应用和选择性光热作用原理的提出，咖啡斑、黄褐斑等色素增加性皮肤病的治疗取得令人满意的疗效[1-2]，现阶段人们对Q开关Nd：YAG 1064nm激光的治疗原理的认识尚仅局限于黑素颗粒对光的选择性吸收，而除此之外对激光照射引起的光生物学作用和细胞凋亡和周期并不清楚。但现己明确两者是密切相关的，阻断细胞增殖周期过程可引起凋亡，而凋亡常伴随有生长阻滞[3]。而临床需要我们对激光照射后黑素细胞周期与凋亡深入研究尤为重要，因此，我们通过实验研究初步探讨Q开关 Nd：YAG激光不同能量照射黄褐斑动物模型对表皮黑素细胞周期与凋亡的影响，现报道如下。 　　1 材料和方法 　　1.1 材料 　　1.1.1实验动物： 根据文献[4]制作慢性应激肝郁型豚鼠黄褐斑实验动物模型12只。 　　1.1.2主要试剂和仪器：RPMI1640培养基、标准胎牛血清、链霉素青霉素双抗、CT、磷酸缓冲盐溶液（PBS）（美国 GIBCO公司）；HMGS 添加剂（美国Cascade Biologics公司）；噻唑蓝（MTT）、二甲基亚砜（DMSO）、碘化丙啶（PI）、0.25%胰蛋白酶、左旋多巴（美国Sigma公司）；Annexin V-FITC 凋亡检测试剂盒及细胞周期检测试剂盒（美国Bender Medsystems公司），bFGF（珠海东大制药）；转铁蛋白（北方同正公司）；Dispase酶（日本三光纯药株式会社）；ABC试剂盒（博士德）； 酶联免疫分析仪（美国Bio-Rad公司）；台式微型离心机上海安亭科学仪器厂； CO2培养箱北京利康仪器科技发展有限公司；流式细胞仪（美国Beckman Coulter 公司）；Q-switched Nd：YAG激光仪（Medlite C6，美国HoYa-ConBio公司） 　　1.2 实验方法 　　1.2.1 照射方法：取慢性应激肝郁型豚鼠黄褐斑实验动物模型造模12只，将每只豚鼠裸露皮肤（8cm×8cm）划分成A（左上区域）、B（右上区域）、C（左下区域）、D（右下区域）四个区域。分别代表不同参数治疗区。A区代表高能量低频率区：3mm光斑 2.5J/cm2，频率1Hz；B区代表高能量高频率区：3mm光斑，2.5J/cm2，频率10Hz；C区代表低能量高频率区：3mm光斑，1.5J/cm2，频率10Hz；D 区代表低能量低频率区：3mm光斑，1.5J/cm2，频率1Hz。每组照射1min，每周照射一次，共照射5次。实验设每只豚鼠自身激光术前为对照。 　　1.2.2 取材方法：分别于激光治疗术前，第1次术后即刻、第5次术后即刻、术后1周、术后3周五次分别切取不同治疗区约1cm×0.2cm全层去毛皮肤一条，术后丝线缝合。根据组织病理和细胞培养观察需要进行处理保存。 　　1.2.3 标本的分离和细胞悬液的制备[5-6]：取下的豚鼠皮肤组织用0.05%洗必泰浸泡消毒10 min；生理盐水漂洗数遍，剪成5mm×2mm的小块；0.25%的DispaseⅡ酶4℃消化（16～24h）；用镊子将表皮与真皮分离；将表皮组织置于0.25%的胰蛋白酶中室温消化10 min；用吸管反复吹打成单细胞；待瓶内液体混浊时加入与胰酶等量的含10%胎牛血清终止消化；100目筛网过滤；吸取细胞悬液于离心管中，1 000r/min 离心10min ；弃上清， 加入RPMI1640培养液重悬细胞，1 000r/min 离心10min；弃上清， 加入黑素细胞培养液（MGM，用RPMI1640培养配制，内含20um/mlbF GF、10%FCS、CT250ng