RNA干扰iNOS基因对腺样囊性癌细胞增殖活性影响.docVIP

RNA干扰iNOS基因对腺样囊性癌细胞增殖活性影响 　　【摘要】 目的：采用RNA干扰（RNA interference，RNAi）技术下调腺样囊性癌细胞株ACC-M中iNOS的表达，探讨其对肿瘤细胞增殖活性的影响。方法：采用siRNA干扰技术下调iNOS表达，RT-PCR法测定细胞内iNOS mRNA的表达；MTT法测定ACC-M细胞增殖活性的变化。结果：与对照组比较，iNOS的siRNA能有效地抑制实验组ACC-M细胞中iNOS的表达（P 　　【关键词】 涎腺腺样囊性癌； 诱导型一氧化氮合酶； RNA干扰 　　涎腺腺样囊性癌（salivary adenoid cystic carcinoma， SACC）是口腔颌面部常见的涎腺恶性肿瘤之一，约占涎腺恶性肿瘤的24%[1]。而且腺样囊性癌具有嗜神经侵袭和肺高转移等特殊的生物学行为。腺样囊性癌对于放疗以及化疗均不敏感，目前仍以手术治疗为主。腺样囊性癌短期预后较好，但远期生存率下降明显。远处转移尤其是肺转移是此类患者的主要致死病因之一。 　　一氧化氮（nitric oxide， NO）是由一氧化氮合酶（nitric oxide synthase， NOS）催化底物左旋精氨酸合成的一种具有多种生物学活性的气体分子。NOS有3种亚型，分别由不同的基因编码，即神经元型NOS（neuronal， nNOS）、诱导型NOS（inducible NOS， iNOS）和内皮型NOS（endothelial， eNOS）。其中又以iNOS是NO合成的关键酶而且与肿瘤发生发展关系最为密切，它广泛存在于人和哺乳动物的许多细胞中，而在肿瘤细胞中表达明显升高，如乳腺癌细胞、肝癌、肺腺癌细胞、腹膜癌、黑色素瘤和口腔鳞癌[2]，本实验拟通过干扰iNOS合成，研究iNOS影响腺样囊性癌的增殖能力。 　　1 材料与方法 　　1.1 细胞培养 腺样囊性癌细胞系高转移株（ACC-M）由中山大学附属孙逸仙医院李劲松教授馈赠。细胞培养于10%的FBS、100 U/ml青霉素和0.1 mg/ml链霉素的DMEM培养液，置于37 ℃，5%（v/v）CO2饱和湿度恒温培养箱中培养。细胞为贴壁生长0.25%的胰酶消化传代。 　　1.2 特异性si iNOS序列 转染腺样囊性癌鳞癌细胞株iNOS-siRNA由广州赛哲生物科技公司设计并合成，经预实验选用特异性iNOS的基因序列见表1。 　　1.3 实验方法 　　1.3.1 基因转染 转染前一天将ACC-M分为si-1，si-2，si-3，si-NC（阴性对照）和MOCK（空白对照）五组，培养基换成不含抗生素的培养基（美国hyclone）；转染当天，细胞汇合率达到70%以上；吸去旧的培养基，用PBS轻洗2次，每孔加入1.6 ml无血清培养基，置于5%CO2、37 ℃培养箱中；取浓度为20 μm的siRNA/microRNA2 μl，加入400 μl无血清培养基中，混匀后，加入4 μl Turbofect siRNA transfection reagent，混匀后在室温下孵育15～20 min。每孔加入上述孵育好的转染复合液400 μl，置于5%CO2、37 ℃培养箱中培养4～6 h后换成正常的完全培养基。转染后24～48 h，检测RNA表达水平。 　　1.3.2 实时荧光定量PCR检测 iNOS引物的设计见表2。 　　TRIzol法提取细胞株中总的RNA，cDNA的合成采用M-MLV反转录试剂盒（Promega）。将合成的cDNA 2 μl加入25 μl反应体系中，在荧光实时定量PCR仪上检测。25 μl反应体系中包括：10×PCR缓冲液2.5 μl，MgCl2 0.75 μl，2 μl 10 mmol/L的dNTPs，1 μl 10 mmol/L的iNOS和VEGF的上下游引物，0.25 μl 5 U/μl的Taq DNA聚合酶，双蒸水17.5 μl。PCR反应条件：预变性95 ℃，15 s；变性95 ℃，5 s；退火延伸60 ℃，30 s，共45个循环。 　　1.3.3 MTT法检测细胞增殖活性 在96孔板中接种细胞（5000个/孔），每孔100 μl。将96孔板放在培养箱中培养（37℃，5%CO2）。24 h后使用turbofect siRNA transfection进行转染。转染24 h、48 h、72 h后向每孔加入10 μl的CCK-8溶液。将培养板在培养箱内孵育1.5 h。用酶标仪测定在450 nm处的吸光值。 　　1.4 统计学处理 应用SPSS 13.0统计学软件对数据进行处理，组间进行单因素的LSD-t检验，以P 　　在笔者以往的研究中发现iNOS在腺样囊性癌中存在着高表达，因此在本实验中在利用ACC-M细胞株沉默了iNOS后检测