非变性聚丙酰胺凝胶电泳.docVIP

非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳 4.1 清洗玻璃板、灌胶用量筒和烧杯，玻璃板气干(制胶用玻璃板为硫化玻璃，灌胶面必须干净无水分，否则灌胶时容易产生气泡；烧杯、量筒和玻璃板如果有水，由于胶与水不相溶，易使胶不能牢固粘在玻璃板上)； 4.2将平口玻璃板和凹口玻璃板放在桌面的支撑物（瓶盖等）上，给玻璃板滴少量100%乙醇，用质量好的纸均匀擦洗制胶面，气干； 4.3 平口玻璃板和凹口玻璃板的三个边均匀的涂抹适量凡士林（凡士林太多不容易清洗）；放上需要厚度的板条，此步应注意密封好板条的相接处，用手将三边和接茬处按牢固，否则容易漏胶；然后用夹子（夹子夹在板条中间）将玻璃板固定于灌胶架上； 4.4 配胶（8%非变性聚丙烯酰胺凝胶，Acr:Bis=37.5:1）、灌胶; 将以下母液按量混合均匀保存于4℃，一般一周内用完， 溶 液 120ml 240ml 40%Acr 24ml 48ml 2%Bis 12.84ml 25.68ml 10XTBE(8.3) 12ml 24ml ddH2O 70.8ml 141.6ml 针对所选用的胶的大小和厚度量取适量以上混合液倒入干净烧杯，加入适量10%APS（催化剂）和TEMED（加速剂），摇匀，灌胶，缓慢插入与胶厚度一致的梳子，同时避免梳齿下产生气泡，待胶凝固；（注：1 聚丙烯酰胺凝胶在凝固以前有毒，凝固后无毒，因此操作时应戴上手套； 2 板条和梳子厚度必须一致，否则将在点样孔中产生胶膜，影响点样和最后电泳质量） 对于20cm x 17cm的玻璃板，除去板条尺寸，胶为16.5cm(宽) x 15.5cm(高) x 1mm(厚)， 配制如下： 胶混合液 10%APS TEMED 一板胶 30ml 180μL 80μL 两板胶 60ml 360μL 160μL 制胶及电泳 （1）胶板的准备：首先确定两块玻璃板是否平整，用去污剂和清水将玻璃板洗涤干净，并用蒸馏水冲洗，用95%乙醇擦拭。 用 ml 95%的乙醇长玻璃短玻璃1ml配置好的亲和硅烷均匀分布于长玻璃面，1ml配置好的剥离硅烷均匀分布于长玻璃面，用ml 95%的乙醇长玻璃短玻璃取0.4mm的边条，置于左右两侧，将短玻璃板压于长玻璃板上，用夹子固定住两侧；以1×TAE配制1%琼脂糖凝胶封住玻璃板底部，用胶带密封；将玻璃板小角度倾斜放置，准备灌胶。 （2）制胶：称取尿素21g加入双蒸水加热溶解，待冷却后加入10ml 5×TBE，7.5ml 40%丙烯酰胺，225μl 10%过硫酸铵和50μl TEMED，，准备灌胶。 （3）灌胶：将制备的胶液沿玻璃板缓慢胶板的空隙，注意不能在胶中形成气泡。胶灌满后，将鲨鱼齿的平端插入胶液下5mm左右，同时防止平端下方出现气泡，于室温下静置h，使胶完全聚合。 （4）预电泳：撕去胶布，拔出，用蒸馏水玻璃板、梳子。1×TBE至没过1×TBE至没过反转，将鲨鱼齿插入凝胶胶面下约0.5mm，梳齿间即加样孔。120w恒功率，预电泳30min。 （5）点样：点样前用加样枪吹吸每个上样槽，将吸干净，以利于样品更好的沉降。把DNA样品与上样缓冲液混合，每个加样孔加5~7μl的扩增产物。 （6）电泳：140-160w恒功率电泳，待溴酚蓝至胶的四分之三处时（大约需要1.5~2h），终止电泳电泳液，取下胶板，将两块玻璃板轻轻分开，胶留在长玻璃板上。 6.1 当第一染料接近胶底边缘，电泳结束，也可使第一染料跑出；关闭电泳仪，移去夹子，取下玻璃板，将胶从玻璃板上小心取下，切去一角或两个角作为记号，以便于辨认，然后开始银染处理，处理均在摇床上进行，具体步骤如下： 10%醋酸(Fix/stop solution) 20分钟 纯水 15分钟 0.2%硝酸银(染液) 30分钟 纯水 10-20秒左右 显影液(Developer solution, 4-10℃) 显影适当 定影液(3%或10%醋酸，加几滴甘油) 5分钟 包胶 注：定影液——将胶在10%的醋酸中处理结束，可向醋酸中加入少许甘油(防止胶在干燥过程中发生胶裂)，摇匀