新一代测序术的原理.pptxVIP

Next-generation sequencing technology overviewAgenda测序技术简史第一代测序技术第二代测序技术第三代测序技术Invention of Nanopore single molecular sequencing (Oxford Nanopore corporation)1 测序技术简史Invention of Heliscope single molecular sequencerchemical degradation method by Maxam-Gilbert method(1977)Invention of personal genome machineInvention of optical mappingsystemInvention of Applied BiosystemsSolid System(2007)Invention of CapillarySequencer(1996)Development of Sanger Sequencing(1977)1950Invention of Illumina Genome Analyzer System(2006)196019701980199020002010Chemical degradation method by Whitfield (1954)Invention of 454 GS 20 Sequencer(2005)Invention of Automated FluorescentSequencer(1985)Invention of Single molecule real time(SMRT) DNA sequencing 1977年，英国人Fred Sanger 发现，如果在DNA复制过程中掺入ddNTP，就会产生一系列末端终止的DNA链，并能通过电泳按长度分辨。 不同末端终止DNA链的长度是由掺入到新合成链上随机位置的ddNTP决定的。 由此诞生了以Sanger命名的测序原理即双脱氧链终止法测序原理。核酸序列形成的基础3′,5′ -磷酸二酯键5′磷酸3′羟基核苷酸形成3?,5?-磷酸二酯键示意图“双脱氧末端终止”的含义TemplatePolymerasePrimerTerminatorGACT终止物标记方法dNTP因为颜色不同，4种终止物可以在一起进行反应。3730xl Sequence MapNext-generation sequencing/Deep sequencing technology main platformsBirthdayPrincipleRoche 4542005PyrosequencingGenome Analyzer/Hiseq 2000Sequencing-by-Synthesis2006ABI SOLiDSequencing-by-Ligation2007454测序原理测序反应以磁珠上大量扩增的ssDNA为模板，在每一轮测序反应中，依照T、A、C、G的顺序依次循环进入，每次只进入一个碱基。如果这种dNTP能与待测序列配对，则会在合成后释放焦磷酸基团。释放的焦磷酸基团会与反应体系中的ATP硫酸化酶反应形成ATP。生成的ATP和荧光素酶共同氧化反应体系中的荧光素分子并发出荧光。通过检测荧光信号释放的有无和强度，确定被测分子的序列。光信号由CCD摄像机检测并反应为峰。每个峰的高度（光信号）与反应中掺入的核苷酸数目成正比。反应结束后，ATP和未掺入的dNTP由双磷酸酶降解，淬灭光信号，并再生反应体系。454测序流程待测DNA文库的构建将基因组DNA/cDNA片段打断至400-800bp，将用于后继的扩增测序的接头A和一段含有生物素的接头B连接到DNA片段上，会产生含有接头AA、AB、BB、BA四种DNA片段，然后与可结合生物素的磁珠结合，其中片段AA被洗脱掉，片段AB\BA\BB结合到磁珠上，通过变性处理回收含有接头A和接头B的单链DNA。Emulsion?PCR将这些ssDNA分别单独与水油包被的直径大约28 μm的磁珠在一起孵育、退火，由于磁珠表面含有与接头互补的寡聚核苷酸序列，因此ssDNA会特异地连接到磁珠上。同时孵育体系中含有PCR反应试剂，因此可以保证每一个与磁珠结合的小片段都会在各自的孵育体系内独立扩增, 扩增产物仍可以结合到磁珠上。反应完成后，破坏孵育体系并富集带有DNA的磁珠。经过扩增反应，每一个小片段都将被扩增大约100万倍，从而达到下一步测序反应所需的模板量。测序将携带DNA的磁珠与其他反应物混合物，放入PTP板中进行测序。PTP板上含有很多直径约为44 μm的小孔，每个小孔仅能容纳一个磁珠，通过这种方法固定每个磁珠的位置以监测接下的测序反应