《候选microRNA反义链干预肝纤维化形成应用研究》可行性.docVIP

《候选microRNA反义链干预肝纤维化形成应用研究》可行性报告 一．立项的背景和意义 肝纤维化（Hepatic fibrosis）是多种慢性肝病病情发展的共同病理基础，是临床向肝硬化发展的必经中间环节。近年来人们对其发生机制进行了广泛探讨，认为早期肝纤维化经有效治疗，仍有逆转可能，我国是肝炎大国，有大量的乙肝病毒(Hepatitis B virus，HBV)及丙肝病毒(Hepatitis C virus，HCV)感染者，其中10～20%的乙肝病毒感染者和高达50%的丙肝病毒感染者将发展为慢性肝炎、甚至肝硬化，积极开展肝纤维化治疗方面的研究显得尤为迫切。 本课题组在已经采用RNA干扰沉默TGFβ/smads相关基因明显减轻肝胶原合成的基础上，通过miRNA芯片技术、生物信息学和分子生物学技术发现的确有些高表达和低表达miRNA可能调控TGF-β1/Smads信号通路相关基因，初步证实了我们以前的猜测。本项目将进一步研究这些候选的miRNA 差异表达变化可能是肝纤维化形成中起桥梁作用，通过寻找“转录因子-miRNA”交互作用的分子网络，期望初步阐明肝纤维化中TGF-β1信号的分子网络调控机制。同时，继成功应用TGFβR2-siRNA 抑制肝纤维化胶原合成后，考虑到miRNA调控基因表达是通过机体的内源性调控通路，具有更高的稳定性和组织相容性，更低的毒副作用，我们将利用筛选的miRNA的反义链和miRNA真核表达质粒在细胞和动物水平调节肝纤维化中 miRNA低和过表达，进行干预肝纤维化实验，试图为今后miRNA治疗肝纤维化提供新靶点和实验数据，具有较高科学意义。 二．国内外研究现状和发展趋势 目前肝纤维化药物治疗主要针对的靶点有去除病因、消除炎症、抑制肝星状细胞激活、抑制肝星状细胞分泌胶原、促进肝星状细胞的凋亡及促进胶原的降解等方面。如：干扰素、秋水仙碱、已酮可可碱、汉防已碱等，但是毒副作用多，限制了临床的应用。近年来，基因阻断技术在机理和功能研究中有很大进展，如：核酶和RNA干扰等，但同样因毒副作用大限制了发展。因此，寻找高效稳定和低毒副作用的抗肝纤维化治疗手段，仍是肝纤维化研究面临的重大课题。 目前研究认为肝脏复杂的炎症细胞因子网络和肝星状细胞（hepatic stellate cells，HSCs）的激活在肝纤维化过程中起关键作用， 不仅是肝纤维化的最终共同途径，而且是肝纤维化发生的中心环节。激活的星状细胞可以转化为肌成纤维母细胞，分泌大量的细胞外基质(Extracellular matrix，ECM)，导致肝脏ECM的合成与降解的失衡，ECM在肝脏的过度沉积导致肝脏结构的改变进而转变为肝纤维化甚至肝硬化 。星状细胞的激活活化、增殖和分泌细胞外基质涉及到复杂的炎症免疫网络，许多信号通路都在肝纤维化形成中起到一定的作用，其中TGFβ/Smads信号转导通路在星状细胞的激活和肝纤维化形成过程中起关键作用。因此，通过干预TGFβ/Smads(transforming growth factor beta，TGFβ)信号转导通路进而干扰星状细胞的活化、增殖和分泌ECM的能力有望能达到治疗肝纤维化的目的。 近年研究表明，小分子RNA（microRNA, miRNA）可能在miRNA 转录后基因沉默中发挥着重要作用。miRNA 是存在于各种生物体内的由19-22 个核糖核苷酸组成的一类新型小分子RNA。miRNA 来自于内源性基因组DNA 的非编码区的直接转录，首先在核内生成miRNA 前体（pre-miRNA），继而在转运体的运载下由细胞核移出至胞浆，经Dicer 酶切割成熟并与Argonaute（ AGO）蛋白组装成RNA 诱导沉默复合体（RNA-induced silencing complex, RISC），并与靶mRNA 通过尚不明确的碱基配对方式互补结合，从而切割降解目的mRNA 或仅抑制靶mRNA 的进一步翻译，产生相应的功能表型缺失，其究竟执行何种功能取决于AGO 蛋白亚类是否具有内切核酸酶活性及miRNA 与miRNA的互补配对程度，这一现象属于转录后基因沉默（post-trans criptional gene silencing, PTGS），基本类似于干扰性小RNA（small interfering RNA, siRNA），但两者亦有着本质区别。siRNA 的发夹状dsRNA 前体多源于病毒感染、外源基因的导入或转座子，因而其主要发挥抗病毒和维持基因组稳定的作用；miRNA 则来自内源基因（定位于着丝点附近）的直接转录。按照人类基因组非蛋白编码区中1-5 %编码miRNA 的保守估计，则细胞中应约有1000余种miRNA，而每一种miRNA 又可按照完全或不完全配对方式调控约200种靶mRNA翻译,则细胞中应有