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小麦中T-2毒素的酶联免疫吸附测定方法 　　中华人民共和国国家标准 　　小麦中T-2毒素的酶联免疫吸附测定方法(ELISA)GB/T14933-94 　　MethodfordeterminationofT-2toxininwheatwithenzyme-linkedimmunosorbentassay(ELISA) 　　1　主题内容与适用范围 　　本标准规定了谷物中T-2毒素的酶联免疫吸附测定方法(ELlSA)。 　　本标准适用于小麦及其制品中T-2毒素的测定。 　　本方法的最低检出量为1μg/kg。 　　第-篇　间　接　法 　　2　原理 　　将已知抗原吸附在固相载体表面，洗除未吸附抗原，加入一定量抗体与待测样品(含有抗原)提取液的混合液，竞争温育后，在固相载体表面形成抗原-抗体复合物。洗除多余抗体成分，然后加入酶标记的抗球蛋白的第二抗体结合物，与吸附在固体表面的抗原-抗体复合物相结合，再加入酶的底物。在酶的催化作用下，底物发生降解反应，产生有色产物，通过酶标检测仪，测出酶底物的降解量，从而推知被测样品中的抗原量。 　　3　试剂 　　本标准所用试剂，凡未指明规格者，均为分析纯，水为蒸馏水或用等纯度的水。 　　　甲醇。 　　　石油醚。 　　　三氯甲烷。 　　　无水乙醇。 　　　乙酸乙酯。 　　　二甲基甲酰胺。 　　　四甲基联苯胺(TMB)。 　　　吐温-20。 　　30%过氧化氢(30%H2O2)。 　　抗体：杂交瘤细胞系1D7产生的抗T-2毒素的特异性单克隆抗体。 　　抗原：T-2毒素与载体蛋白-牛血清白蛋白(BSA)的结合物。 　　兔抗鼠免疫球蛋白与辣根过氧化酶的结合物(酶标二抗)。 　　ELISA缓冲液系统 　　包被缓冲液为的碳酸盐缓冲液,称取碳酸钠(Na2CO3),碳酸氢钠(NaHCO3)，加水稀释至1000ml。 　　洗液为含%吐温-20的的磷酸盐缓冲液(简称为PBS-T)配制方法为： 　　称取磷酸二氢钾(KH2PO4),磷酸氢二钠(),氯化钠(NaCl),氯化钾(KCl),吐温-20,加水至1000mL。 　　　底物缓冲液为的磷酸-柠檬酸缓冲液，配制方法为： 　　/L柠檬酸(C6H8O7*H2O)，即称取柠檬酸，加水至1000mL，为甲液: 　　/L磷酸氢二钠(Na2HPO4),即称取磷酸氢二钠，加水至1000mL，为乙液: 　　取甲液，乙液，加水至100mL，即可。 　　　底物溶液：取50μLTMB(10mgTMB溶于1mL二甲基甲酰胺中)溶液+10mL底物缓冲液+10μL30%过氧化氢，混均。 　　T-2毒素标准溶液 　　用甲醇配成1mg/mLT-2毒素贮备液,-20冰箱贮存，于检测当天，精密吸取贮备液，用20%甲醇的PBS(配制方法同PBS-T，不加叶温-20即可)稀释成制备标准曲线的所需浓度。 　　4　仪器　　所有玻璃器皿均用硫酸洗液浸泡，用自来水、蒸馏水冲洗。 　　　酶标检测仪。 　　　酶标板(40孔或96孔)。 　　　电动振荡器。 　　　电热恒温水浴锅。 　　　具尾管的10mL小浓缩瓶。 　　5　分析步骤 　　　提取 　　称取20g粉碎并通过20目筛的样品，置200mL具塞锥形烧瓶中，加8mL水和100mL三氯甲烷-无水乙醇(4:1)，密塞，振荡1h，通过滤纸过滤，取25mL滤液于蒸发皿中，置90水浴上通风挥干。用50mL石油醚分次溶解蒸发皿中残渣，洗入250mL分液漏斗中，再用20mL甲醇-水(4:1)分次洗涤，转入同一分液漏斗中，振摇,静置约15min，收下层甲醇-水提取液过层析柱净化(层析柱的装备：在层析柱下端与小管相连结处塞约脱纸棉，尽量塞紧，先装入中性氧化铝，敲平表面，再加入活性碳，敲紧)。 　　将过柱后的洗脱液倒入蒸发皿中，并于水浴锅上浓缩至干，趁热加3mL乙酸乙酯，加热至沸，挥干，再重复一次，最后加3ml，乙酸乙酯，冷至室温后转入浓缩瓶中。用适量乙酸乙酯洗涤蒸发皿，并入浓缩瓶中。将浓缩瓶置95水浴锅上，挥干冷却后。用含20%甲醇的PBS定容，供ELISA检测之用。 　　ELISA检测 　　　用T-2-BSA(4μg/mL)包被酶标板，每孔100μL，4过夜； 　　　酶标板用PBS-T洗3次、每次3min后，加入不同浓度的T-2标准溶液(制作标准曲线)或样品提取液(检测样品中的毒素含量)与抗体溶液的混合液(1:1，每孔100μL，该混合液应于使用的前一天配好，4过夜备用)，置371h； 　　　酶标板洗3次，每次3min后，加入酶标二抗，每孔100μL，37，； 　　　同上述洗涤后，加入底物溶液，每孔100μL，3730min； 　　　用1mol/L硫酸溶液终止反应，每孔50μL，于450nm处测定吸光度值。 　　6　计算T-2浓度(ng/g)=C×V1/V2×D×1/M式中：C--酶标板上所测