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产淀粉酶芽孢杆菌的分离筛选及发酵;项目名称;1产淀粉酶芽孢杆菌的初筛初筛准备;淀粉培养基:;初筛方案;表1 初筛结果一;分区划线;表2 初筛结果二;将分区划线生长好的菌落进行点接培养,用枪头蘸取平皿中长势良好的(划线法中较好的菌株后代)进行点接培养,并作平行试验。;革兰氏染色;;芽孢染色;;产淀粉酶芽孢杆菌的复筛;DNS试剂的制备:称取0.65gDNS溶于少量热蒸馏水中,溶解后移入100ml容量瓶中,加入2mol/L氢氧化钠溶液32.5ml,再加入4.5ml丙三醇,摇匀,冷却后定容至100ml。
;;; 1.发酵液离心(8000r/min 5min),然后弃菌体。
2.取离心发酵液1ml加入5ml 1%淀粉溶液水浴37度5分钟(淀粉水解)再沸水浴5分钟(使酶失活)再取1ml处理液并加入DNS2ml沸水浴迅速冷却再加入9ml蒸馏水,540nm测定波长。
3.取1ml上清液加入5ml1%淀粉溶液直接沸水浴5分钟,再取1ml处理液并加入DNS2ml沸水浴迅速冷却再加入9ml蒸馏水。
;;平板扩散法测酶活;表6 平板扩散法复筛结果;菌种保藏
1.试管斜面保藏
配培养基灭菌制作试管斜面,划线接种37°C恒温培养48小时,密封冷冻保存。(标签)
2.甘油管保藏
取1ml蒸馏水和1ml甘油配制成50%甘油灭菌,取液体菌种2mL加入甘油管中混匀,培养、密封(-20摄氏度)冷冻保存。(标签)
; 种子的扩大培养
根据DNS法和平板法的结果选出生长旺盛的菌种
;发酵罐的消毒灭菌;灭菌后加入培养基进行实消,打开夹套排污阀(0.11mpa至95度)向管内进蒸汽 (121度20分钟) 进行换气(罐压力0.05至0.08mpa),最后降温至发酵所需的温度。;实消结束后接入菌种
确认罐压(0.05-0.08)擦干净接种区域,放上火焰圈点燃后,往火焰中间倒菌种。
搅拌均匀后,先通入蒸汽放出废液,再取样,每半个小时取一次样。测定菌种量的变化和酶的活性。;
产淀粉酶芽孢杆菌生长曲线的测定
以培养基和稀释5倍的培养基做空白,把每半小时取一次样的菌液稀释5倍(2ml菌液加8ml蒸馏水)的液体和原菌液放入比色皿中,用分光光度计测定OD值。
;;;;发酵完成后,放出发酵罐中的发酵液,清洗发酵罐。
整理实验台,清洗仪器。
打扫实验室卫生。
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