基因工综合性教学实.doc

2012最新文档-管理系列 (word可编辑版)  基因工程综合性教学实验 大肠杆菌碱性磷酸单酯酶基因 克隆 表达 纯化 班 级 生科02 姓 名 孔 璐 学 号 021573 组 员 宋孜珺 生 物 工 程 学 院 华 东 理 工 大 学 二五年六月 1 2 材料与方法 2.1 实验材料与仪器 2 2.2 DNA的琼脂糖凝胶电泳 3 2.3 DNA的酶切 4 2.4 DIG分子杂交 4 2.5 目的基因的PCR克隆 5 2.6 DNA的抽提制备 7 2.7 目的基因片段的回收 8 2.8 DNA的连接与转化 9 2.9 目的基因的表达 10 2.10 细胞破碎 11 包涵体洗涤、溶解、复性 1 2.12 酶活及蛋白含量检测 12 2.13 DEAE纤维素fast fluid凝胶层析 12 2.1 Sephadex G-100凝胶层析 13 2.1 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳 14 2.1 目的蛋白分离纯化中的计算 16 2.1 完整的实验流程 17 3 实验结果及讨论 3.1 碱性磷酸单酯酶基因在大肠杆菌染色体上的定位 20 3.2 大肠杆菌碱性磷酸单酯酶基因的克隆 21 3.3 大肠杆菌碱性磷酸单酯酶基因表达载体的构建 23 3.4 大肠杆菌碱性磷酸单酯酶基因的表达分析 25 3.5 大肠杆菌碱性磷酸单酯酶的分离纯化 26 4 小结 34  1. 前言 碱性磷酸单酯酶（Alkaline Phosphatase EC3.1.3.1，简称：AKP或ALP）又称碱性磷酸酯酶，碱性磷酸酶。它是一种金属锌酶，在磷酸盐代谢中起重要作用。 碱性磷酸单酯酶广泛分布于原核及真核生物各组织中，一般存在于外周胞质中。与其他分泌蛋白一样，它是以前体形式分泌的，在膜通道中最终形成成熟的碱性磷酸单酯酶，成为主要存在于质膜上的一种膜结合蛋白。在哺乳动物中已知有四种该酶的同工酶，它们通过与GPI Anchor结合连接在细胞膜上。其中三种是组织专一性的，存在与胎盘，生殖细胞和肠内；另一种是非组织专一性的，从前被称为肝骨肾同工酶。 碱性磷酸单酯酶以二聚体形式存在，每条单链47.05kD。这两条链的蛋白序列完全相同，但二级结构有细微差异。每条单链含两个锌离子，一个镁离子和一个磷酸基团，锌离子的作用是稳定酶的三级和四级结构，镁离子参与催化反应，磷酸基团是酶的配基。因此，当该酶的活性中心结合这两种金属离子以后，酶活力将大大增加。 碱性磷酸单酯酶是一种非特异性水解酶，能水解磷酸单酯键，但不水解磷酸二酯键。它可作用于多类底物，如β-甘油磷酸、葡糖-1-磷酸、5-磷酸核黄素等。最适温度37℃，最适pH10，对底物只有相对的专一性，在它在碱性条件下，能水解磷酸酯：单磷酸酯＋水＝醇＋磷酸。它有两个主要的用途：一是将载体末端的磷酸基除掉，避免在DNA重组时载体分子的自我连接；二是和T4多聚核苷酸激酶连用，用于DNA的末端标记。碱性磷酸单酯酶的单体有两种形式，可以通过其氨基末端是否有精氨酸残基来区分。同工酶Ⅰ的精氨酸氨基末端残基被切割开后即形成同工酶Ⅲ。 碱性磷酸单酯酶的抑制剂有二乙三胺五乙酸，N-双（2-羟乙基）呱嗪-N-2（乙磺酸），乙二胺四乙酸（EDTA），邻二氮杂菲，巯基羧酸（如半胱氨酸，巯基乙酸等），焦磷酸盐。氰化物是该酶的强烈抑制剂。 当溶液pH低于3时，该酶释放出锌离子形成单体而失活。该酶对热稳定，85℃加热30min仍保留活性，当有镁离子存在时可增加酶的热稳定性。 碱性磷酸单酯酶?的结构基因phoA位于E．coli遗传图上的8.5min处，其表达受到很多基因如phoB,phoM,phoR,phoS,phoT和perA的影响。该基因在低磷酸盐条件下被诱导而大量合成碱性磷酸单酯酶，促进磷酸盐代谢，但在高磷酸盐条件下此反应则被抑制。 碱性磷酸单酯酶在临床上有重要的生理意义。其酶活力增高或降低均标志着某些疾病的产生。 本实验采用上游实验载入克隆的碱性磷酸单酯酶基因phoA的大肠杆菌作材料，从培养的菌体中提取、纯化碱性磷酸单酯酶。该菌体表达的碱性磷酸单酯酶以分泌于周质间隙的可溶性蛋白和以包涵体的形式分泌的蛋白组成，我们下游的实验主要是对包涵体进行分离纯化。 通过对本实验的学习和操作，我们初步掌握了基因工程中的理论和一些常规操作方法，如DNA的酶切，电泳，制备，连接，回收，分子杂交，基因表达产物的分离纯化等，提高了实验技能，并对整个实验流程有了感性的认识，为今后的类似的实验打下了基础。 2. 材料与方法 2.1实验材料与仪器 2.1.1 试剂 1. 酶：EcoRI, EcoRV, BglI, NcoI, NdeI, BamHI, PstI, XbaI, HindIII, Taq 2. 质粒:：pMD18-T, pET-11a