球虫试验计划.docVIP

摘要：对南昌市场购买的成年鸡肠道，采用饱和盐水漂浮法检查，同时从肠内容物中获取混合球虫卵囊。在制备好的琼脂薄 层的载玻片上滴加稀释适度的混合卵囊液。在显微镜下用手术刀片小心切割琼脂薄层，达到琼脂薄层上仅剩单一卵囊的 严格要求。把单一卵囊包裹后经口感染雏鸡，又从感染雏鸡粪便中收集大量球虫卵囊待孢子化后再次重度感染雏鸡，掌握 该球虫虫株特征及感染鸡的病理变化。结果表明：单卵囊感染雏鸡，感染率为40%；经增殖传代球虫卵囊感染雏鸡虫株，初 步鉴定为鸡堆型艾美耳球虫( Eimeria acevulina)。 关键词：堆型艾美耳球虫；南昌株；分离；鉴定 v1 材料与方法 1.1 材料 1.1.1 混合球虫卵囊。从南昌市场购买成年鸡肠道内 容物获取。 1.1.2 试验动物。1 日龄雄性雏鸡20 只（购自南昌青 云谱区，熊坊乡某孵化场） 1.1.3 试验药品。重铬酸钾（AR 级），食用盐（江西盐 业集团公司），琼脂条。 1.1.4 试验器械。生化培养箱，离心机，普通天平，内 光源生物显微镜，1 000W 双联电炉，数码照相机， 物测微尺和目测微尺，钢铝锅，500 mL 搪瓷杯，60 mL 三角瓶，60 目铜筛，260 目尼纶筛，眼科镊，胶头 吸管，250mL 烧杯。 1.2 方法 1.2.1 饱和食盐水与2.5%重铬酸钾液的制备。以量 筒量取清水1 000mL 至钢铝锅内，电炉加热沸腾， 倒入食盐380 g 搅拌、溶解、冷却、过滤即为饱和盐 水；以重铬酸钾25 g 溶于1 000 mL 清水中即为 2.5%重铬酸钾液。 1.2.2 混合球虫卵囊检查、收集培养。取肠内容物于 搪瓷缸内，加少量饱和盐水捣碎搅拌成糊状，再加 65mL 饱和盐水搅匀，经60 目铜筛和260 目尼纶筛 过滤，滤液盛满60mL 的三角瓶内并成凸形，静置 20min 后载玻片触及凸点迅速翻转，在16×16 倍显 微镜下观察寻找卵囊，发现大量卵囊后用胶头吸管 吸取上浮液于青霉素空瓶内，兑加2.5%重铬酸钾液 3mL，置30℃生化培养箱内培养24 h 备用。 1.2.3 雏鸡的饲养与管理。雄性雏鸡饲养于杀灭卵囊 的纸盒内或大鼠笼内，饲喂新鲜小鸡料和洁净清 水，每次做到先洗手后饲喂雏鸡，杜绝意外球虫卵 囊感染。 1.2.4 单卵囊分离。用天平秤取琼脂条1 g 于250mL 烧杯中，添加清水100 mL，电炉加热沸腾搅拌成透 明状，趁热用胶头吸管滴加胶冻液于载玻片上，待 冷却后再用胶头吸管取已孢子化的混合球虫卵囊 于成型的琼脂薄层上，置显微镜下逐行寻找球虫卵 囊，卵囊密度控制在每个视野约有5~7 个，显微镜 观察下用手术刀片细心切割琼脂薄层，使琼脂薄层 上仅留一个球虫卵囊，确认一个卵囊后将该小块琼 脂转移置较大琼脂薄层上并包裹好。 1.2.5 单卵囊感染。在助手协同下打开雏鸡喙，将包 裹物经口腔滴加少量清水确认喂服。共感染10 只7 日龄雏鸡，记录感染时间，分笼饲养。 1.2.6 纯种子代卵囊收集与感染。第4~8 d 开始每天 用饱和盐水漂浮法检查雏鸡新鲜粪便，当检查有球 虫卵囊时记录鸡只和排出卵囊时间并开始收集卵 囊。取新鲜雏鸡粪便于500mL 搪瓷杯内，杯内装有，杯内装有 一定量的5℃清水。待收集一定量粪便后，将搪瓷杯 内原有的清水倾去并捣碎成糊状，加350mL 清水混 匀，经60 目铜筛及260 目尼纶筛过滤，滤液分装8 支离心管，每支45 mL，以2 000 r/min 离心5 min；留 沉淀物，取少许沉淀物与10 mL 饱和食盐水搅拌。 搅拌后8 支管归装于1 支管。倒完沉淀物的7 支离 心管分别加10mL 清水，以2 000 r/min 离心5 min， 留含沉淀物离心管内的上液弃沉渣，再兑加清水至 45mL 处，以2 000 r/min 离心10 min，弃上清液留沉 淀溶液少许，这样加清水重复离心洗净，最后将富 含卵囊沉淀液从离心管中用吸管吸出移入60 mL 三角瓶内[7]，加等量5%重铬酸钾液置30℃生化培养 箱内培养。 1.2.7 纯种孢子化卵囊感染。胶头吸管吸取含大量卵 囊液，经口感染12 日龄雏鸡10 只，7 d 后每天剖检 2 只雏鸡，观察肠道表面病变情况并照相。 1.2.8 虫株的鉴定。取少量已孢子化的球虫卵囊液于 载玻片上，在16×40 倍显微镜下观察发现该球虫卵 囊有几种形态，有无极粒、卵囊及孢子囊残体、斯氏 体等。用显微测微尺测量卵囊大小及孢子囊大小， 测量100 个该卵囊，算出其卵囊大小的平均值及卵 囊形状指数，结合潜隐期及肠道表面病变部位,比对 感染雏鸡病理变化 堆型艾美耳球虫多在上表皮层发育，并且同一 发育阶段的虫体聚集在一起；被损害的十二脂肠和 小肠前段出现大量白色小斑点，引起肠道肿胀、出 血。（2.4 雏鸡感染球虫卵囊虫株的鉴定 采用1