浅谈S-腺苷甲硫氨酸合成酶基因克隆表达与分离纯化.docVIP

浅谈S-腺苷甲硫氨酸合成酶基因克隆表达与分离纯化 　　[摘　要] S-腺苷甲硫氨酸是广泛存在于生物体内的重要代谢中间物质，在体内参与DNA甲基化、蛋白质甲基化、多胺合成等众多的生物化学反应。在体内，S-腺苷甲硫氨酸合成酶催化ATP和甲硫氨酸（Met）形成S-腺苷甲硫氨酸。本文参考苏云金芽孢杆菌基因组中S-腺苷甲硫氨酸合成酶序列信息设计引物，通过PCR技术从芽孢杆菌属B.thuringiensis Dip20株菌中扩增得到SAM合成酶基因片段，插入大肠杆菌融合表达载体pGEX-6p-1构建了表达载体pGEX-SAM。将所构建的SAM合成酶表达载体pGEX-SAM转入大肠杆菌（Escherichia coli）DH5α 经IPTG诱导后，SDS分析表明成功表达了SAM合成酶。进一步通过亲和层析成功的纯化了SAM合成酶。 　　[关键词] 克隆；表达；S-腺苷甲硫氨酸合成酶；亲和层析；蛋白纯化 　　一、研究意义 　　S-腺苷甲硫氨酸（SAM）是广泛存在于动物、植物和微生物体内的重要代谢中???物质，也是人体内一种重要的生理活性物质，参与了40多种生化反应。在生物体代谢网络中，S-腺苷甲硫氨酸的生物合成由S-腺苷甲硫氨酸合成酶[EC2.5.1.6]催化甲硫氨酸（Met）和ATP反应完成，即来自于ATP的腺苷部分攻击甲硫氨酸的硫原子，生成高能量、活泼的有机硫化合物，具有生物活性的（-）S-腺苷甲硫氨酸在体内主要起着转甲基、转硫、转氨丙基的作用。其中最主要的功能是作为甲基的供体参与甲基化作用，如蛋白质，核酸的甲基化等。同时在植物体内他还作为氨丙基的供体参与乙烯的合成。 　　二、材料与方法 　　1.菌株与质粒 　　大肠杆菌Escherichia coli DH5α，B.thuringiensis Dip20，质粒（plasmid）pGEX-6P-1，pGEX-SAM。 　　2.培养基及生化试剂 　　培养基：（1）LB（Luria- Bertani）培养基 　　质粒抽提试剂：（1）SolutionⅠ，（2）SolutionⅡ，（3）Solution Ⅲ（4）PBS缓冲液（pH7.4）：（5）氨苄青霉素。限制性内切酶，PCR引物。 　　三、方法步骤 　　B.thuringiensis Dip20总DNA的提取：将B.thuringiensis Dip20接种于5mL LB培养基中，37℃、220 r/min培养16h以上。取培养物1.5mL离心收集菌体。加入567μLTE缓冲液，30μL 10%SDS，3μL蛋白酶K，混匀，37℃温浴1h。加入100μL5M NaCl，混匀，再加入80μL CTAB，混匀，70℃水浴10min。加入0.7倍体积的氯仿-异戊醇混匀。离心5min。转移上层亲水相，加入等体积苯酚-氯仿-异戊醇，离心5min。再将上层水相转移到新的离心管中，并加入0.6体积的异丙醇，冰上5min。然后12000r/min离心5min，沉淀重悬与50μLTE缓冲液中。加入1μL RNA酶，37℃作用15min。取5μL 0.7%琼脂糖凝胶电泳检测基因组提取结果。 　　PCR的基本反应步骤：（1）变性——将反应体系加热至95℃，使模板DNA完全变性成为单链，同时引物自身和引物之间存在的局部双链也得以消除；（2）退火（anneal）——将温度下降至适宜温度使引物与模板DNA退火结合；（3）延伸，将温度升至72℃，DNA聚合酶以dNTP为底物催化DNA的合成反应。 　　PCR产物纯化与酶切：将PCR扩增得到的PCR产物，通过0.7%琼脂糖凝胶电泳回收1200bp条带，DNA凝胶纯化试剂盒纯化PCR产物。纯化后的PCR产物以0.7%琼脂糖凝胶检测。纯化后的PCR产物进行与XhOⅠ双酶切。 　　pGEX-S-腺苷甲硫氨酸合成酶表达载体的构建：将经过BamHⅠ与XhoⅠ双酶切的pGEX-6p-1载体与PCR扩增片段按约3：1的摩尔混合，混匀后，4℃连接12h后转化大肠杆菌DH5α超级感受态，由于pGEX-6p-1有氨苄青霉素抗性，因此在含100μg/mL氨苄青霉素LB平板培养基上筛选阳性克隆。 　　感受态细胞的制备与酶物的连产转化：1﹒取保存的菌接种于LB固体培养基，37°C培养过夜（不超16h）。2﹒挑取单菌落至5mLLB液体培养基，37°C，200r/min培养过夜。3﹒按1：100取1mL培养菌液转入100mL LB液体培养基中，37℃，250r/min培养至OD600=0.3至0.4，立刻置于冰上10min（冰上操作要轻柔，避免较大的振荡）。4﹒4000rpm离心5min去上清，加入2.5mL 0.1M Mg2SO4溶液，悬浮沉淀，冰浴15min。5﹒4000rpm离心5min，去上清，加入2.5mL 0.1M CaCl2及15%甘油，悬