基因工程大肠杆菌发酵生产α-环糊精葡萄糖基转移酶培养基优化.docVIP

基因工程大肠杆菌发酵生产α-环糊精葡萄糖基转移酶培养基优化 　　摘要：对基因工程大肠杆菌发酵生产α-环糊精葡萄糖基转移酶的培养基进行了优化，首先通过单因素试验，挑选出对菌株产酶有较大影响的因子及浓度范围，再通过两水平析因试验和最陡爬坡试验确定显著影响因子和浓度拐点，最后采用响应面分析法确定得到培养基成分的最佳配比为：甘油 10.74 g·L-1，酵母提取物51.85 g·L-1，酵母蛋白胨10 g·L-1，磷酸氢二钾22.82 g·L-1，磷酸二氢钾2.85 g·L-1。与原始培养基生产水平相比，采用优化培养基后，酶活提高了48.4%。 　　关键词：基因工程；大肠杆菌；α-环糊精葡萄糖基转移酶；最陡爬坡试验；响应面设计 　　中图分类号： Q936 文献标识码：A DOI编码：10.3969/j.issn.1006－6500.2012.06.018 　　环糊精（Cyclodextrin，简称CD）是由直链淀粉经酶解环合后得到的由6个以上葡萄糖连结而成的环状低聚化合物。环糊精具有独特的环状中空圆筒型的立体结构，与客体分子形成包合物后可有效地改善客体分子的物理化学性质，因此，环糊精在食品、医药、农业、纺织、环保、化妆品、生物技术和分析化学等领域具有广泛的应用。 　　1 材料和方法 　　1.1 材 料 　　1.1.1 菌种 基因工程大肠杆菌由安琪酵母股份有限公司提供。 　　1.1.2 试 剂 酵母浸出物（FM818，简称YE）由安琪酵母股份有限公司生产；酵母蛋白胨由安琪酵母股份有限公司生产；其它试剂均为分析纯AR。 　　1.2 方 法 　　1.2.1 种子培养 将斜面菌接入装有50 mL培养基的250 mL三角瓶中，在37 ℃和转速为200 r·min-1回转式摇床上培养8 h。 　　1.2.2 发酵培养 取5 mL种子液接入装有100 mL培养基的500 mL三角瓶中，在30 ℃和转速为200 r·min-1回转式摇床上培养36 h。 　　1.2.5 菌体量测定 取发酵液用适量蒸馏水稀释一定倍数，振荡均匀后，用可见光分光光度计于600 nm处测量其光吸收值（OD600）。 　　2 结果与分析 　　2.1 培养基单因素试验与结果 　　本研究在碳源方面考察了甘油浓度，并考察了3种复合氮源。由表1可知，当甘油浓度为9 g·L-1时，菌体浓度和酶活力均达到最大。YE浓度增加，对菌体浓度的增长有正向促进作用，但对酶活力增长不利；同时，在有牛骨蛋白胨的条件下，酶活力显著增加。在仅有牛骨蛋白胨的条件下，酶活力的表现与牛骨蛋白胨浓度呈正相关。横向与酵母蛋白胨的影响进行比较，牛骨蛋白胨对菌体浓度和酶活力的促进作用显得不足。随着复合磷酸盐浓度的增加，菌株产酶出现明显的增长，并在28.55 g·L-1时达到最高，说明环境pH值对菌株产酶有较大影响。 　　2.3 验证试验 　　3 结论 　　由试验得知，甘油、酵母浸出物、酵母蛋白胨、复合磷酸盐对基因工程大肠杆菌发酵生产α-环糊精葡萄糖基转移酶有一定影响。通过两水平析因试验分析，甘油和酵母浸出物是显著影响因子。对这二者进行响应面设计，通过软件分析，得到培养基成分的最佳配比为：甘油为10.74 g·L-1，酵母浸出物FM818为51.85 g·L-1，酵母蛋白胨FP101为10 g·L-1，磷酸氢二钾为22.82 g·L-1，磷酸二氢钾为2.85 g·L-1 。采用优化后的培养基进行验证试验，与原有培养基相比，酶活值提高了48.4%。本研究为α-环糊精葡萄糖基转移酶的发酵生产奠定了基础，具有一定指导作用。 　　参考文献： 　　[1] Uitdehaag J, van der Veen B A, Dijkhuizen L, et al. Catalytic mechanism and product specificity of cyclodextrin glycosyltransferase, a prototypical transglycosylase from theα-amylase family [J]. Enzyme and Microbial Technology, 2002, 30: 295-304. 　　[2] van der Veen B A, Uitdehaag J, Dijkstra B, et al. Engineering of cyclodextrin glycosyltransferase reaction and product specificity [J]. Biochimica et Biophysica Acta, 2000, 1543: 336-360. 　　[3] Li Z F, Wang M, Wang F, et al. γ-Cyclodextrin: A