分子生物研究方法.ppt

第五章 分子生物学研究方法 5.1 重组DNA技术发展史 5.2 DNA操作技术 5.3 基因克隆技术 5.4基因表达研究技术 5.5蛋白质组学及研究技术 目的基因的来源 原核细胞 真核细胞：cDNA或gDNA文库 人工合成及PCR扩增目的基因 噬菌体载体：双链DNA病毒，约50kb,两端有一个12个核苷酸5′端突出粘性末端 个克隆载体所容纳的外原DNA片段的大小 质粒：10kb λ噬菌体：23kb 黏粒：45kb BAC：350kb YAC：1000kb 5.2.1 细菌转化 常用的转化方法： 化学转化（CaCl2）法 电击法 化学转化原理： 在0℃冷冻处理时，处于CaCl 2低渗溶液中的大肠杆 菌细胞膨胀成球形。DNA可吸附于其表面。在短暂的 热冲击下，细胞吸收外源DNA ，然后在丰富培养基内 复原并增殖，表达外源基因。 电击转化： 使用低盐缓冲液或水洗制备的感受态细胞，通过 高压脉冲的作用将载体DNA分子导入受体细胞。 克隆的筛选： 抗生素基因。 常用的抗生素有：氨苄青霉素、卡那霉素、氯霉素、四环素、链霉素等 ?-互补蓝白斑筛选 营养条件（自养、异养） ?-互补筛选 β-半乳糖苷酶基因（LacZ）的调控序列和氨基端（N端）146个氨基酸编码序列的质粒 编码β-半乳糖苷酶羧基端（C端）部分序列的宿主细胞 IPTG/X-gal的培养基上筛选蓝白斑 蓝白斑筛选 Lac Z , IPTG  X-gal X + gal  （白色） （蓝色） Lac Z（失活） , IPTG  X-gal X-gal  （白色） （白色） 蓝白斑 转化率的计算： 转化体总数＝菌落数×（转化反应原液总体积/涂板菌液体积） 插入频率＝白色菌落数/蓝色菌落数+白色菌落数 转化频率＝转化体总数/加入质粒DNA的量（计算出每微克的转化菌落数） 5.2.2 聚合酶链式反应（PCR）技术 1985年，K.Mullis等研究成功的一种在体外快速扩增特定基因DNA序列的方法 原理：类似于天然的DNA复制过程。将待扩增的DNA片段和两侧互补的两段寡核苷酸引物，经过变性，退火和延伸若干个循环后，DNA扩增倍数可达2n 倍 反应体系 模板DNA：待扩增的目的片段 特异性引物：人工合成的与待扩增的靶DNA两端序列互补的寡核苷酸片段，15-30bp DNA聚合酶 dNTP 含有Mg2+的缓冲液 PCR技术在基因克隆方面的应用 （1）目的基因的直接克隆， （2）通过RT-PCR进行cDNA的克隆； （3）制备DNA探针，进行分子检测等。 5.2.3 cDNA文库 cDNA文库(complementary DNA library)以组织细胞中的mRNA为模板，反转录合成双链cDNA ，各cDNA分子分别插入载体形成重组子，再导入宿主细胞克隆扩增。这些在重组体内的cDNA的集合即cDNA文库。 构建步骤： 1、高质量mRNA制备：纯化试剂盒，生物素 文库中筛选目的基因 5.2.3 SNP技术应用 （single nucleotide polymorphism）单核苷酸多态性，指基因组DNA序列中由于单个核苷酸的突变而引起的多态性 一个SNP表示在基因组某个位点上有一个核苷酸的变化，源于单个碱基的转换或颠换 应用：遗传病研究、动植物遗传育种 5.2.4 基因敲除技术（gene knock-out） 通过一定的途径使特定的基因失活或缺失的技术。通常意义上的基因敲除主要是应用DNA同源重组原理，用同源片段替代靶基因片段，进行精确的定位修饰和基因改造，同染色体一起稳定遗传 完全基因敲除 条件型基因敲除 植物基因敲除株系筛选（T-DNA插入失活） 5.3 基因克隆技术简介 5.3.1 RACE(rapid amplification of cDNA ends) 5.3 基因克隆技术简介 5.3.1 cDNA差示分析法(cDNA-RDA法) 差减杂交与RT-PCR方法相结合，通过降低cDNA群体复杂性和更换cDNA两端接头等方法，特异扩增目的基因片段 5.3.3 酵母双杂交体系?（Yeast tow-hybrid system）? 主要实验