生存素下调多药耐药蛋白增强人鼻咽癌细胞株对紫杉醇敏感性研究.docVIP

生存素下调多药耐药蛋白增强人鼻咽癌细胞株对紫杉醇敏感性研究 　　杨 宁1 朱乐攀2 谭 潭2 侯春燕1 　　1.湖南省郴州市第一人民医院耳鼻喉科，湖南郴州 423000； 　　2.湖南省郴州市第一人民医院检验科，湖南郴州 423000 　　[摘要] 目的 研究生存素（Survivin）下调多药耐药蛋白（MRP）的表达与鼻咽癌紫杉醇（PTX）耐药性关系，探讨鼻咽癌PTX耐药的分子机制。 方法 采用免疫组化检测Survivin和MRP在42例鼻咽癌PTX耐药患者与24例PTX非耐药患者中的表达；采用浓度递增法持续诱导建立鼻咽癌化疗耐药细胞株5-8F-PTX（+），绘制细胞生长曲线，测定细胞生长的倍增时间，检测肿瘤细胞的周期分布；采用siRNA技术干扰5-8F-PTX（+）中Survivin的表达后，Western blot法检测Survivin和MRP表达变化，MTT检测不同抗肿瘤药物PTX、顺铂（cDDP）、5-氟尿嘧啶（5-FU）、长春新碱（VCR）耐药敏感性的变化。 结果 Survivin在鼻咽癌化疗耐药患者中阳性表达率为83.3%，明显高于非耐药患者（41.7%），差异有高度统计学意义（P 　　[Key words] NPC； Paclitaxel； Drug resistance； Survivin； MRP 　　鼻咽癌（NPC）是头颈部肿瘤中常见的恶性肿瘤，在中国南方其发病率居世界首位[1]。临床上，鼻咽癌确诊时往往已经到了晚期，其临床治疗方式是放疗和化疗相结合的方法，其临床疗效比较差，其5年无病生存率小于60%，化疗耐药的产生是鼻咽癌化疗失败的主要原因之一[2]。紫杉醇（PTX）是临床上鼻咽癌化疗的主要首选药物之一。临床上出现PTX耐药现象，是其临床治疗障碍主要原因之一[3]。目前，鼻咽癌通过PTX化疗后产生耐药性的分子机制并不清楚。肿瘤的多药耐药（multi-drug resistance，MDR）的本质是肿瘤细胞面对化疗药物时所建立起来的一种自我保护程序，通常会导致恶性肿瘤的治疗失败[4]。MDR与多药耐药蛋白（MRP）关系是肿瘤耐药研究当中的重点，许多肿瘤中出现MDR现象大多数与MRP表达增高有关[5]。研究发现，许多恶性肿瘤组织中发现有生存素（Survivin）的表达增高；Survivin与肿瘤细胞的化疗耐药性有关[6]。本研究通过研究Survivin和MRP之间的关系及其与鼻咽癌PTX耐药的关系，为临床上鼻咽癌PTX耐药的靶向逆转治疗提供实验支持。 　　1 资料与方法 　　1.1 一般???料 　　选择2010～2012年郴州市第一人民医院耳鼻喉？科66例鼻咽癌PTX治疗患者为研究对象，患者临床化疗方案为：PTX：135 mg/m2，1次/d，共1 d；顺铂（cDDP）30 mg/m2，共3 d。化疗后根据患者是否PTX耐药分为鼻咽癌PTX耐药42例和鼻咽癌PTX非耐药患者24例，PTX临床耐药判断标准：化疗前和化疗结束后第3天对患者的肿瘤部位进行CT检查，通过电脑软件测量肿块的体积，体积无明显改变或变大者为PTX耐药患者，体积明显缩小为治疗有效（PTX非耐药）患者。 　　1.2 主要试剂 　　苏木精、S-P即用型免疫组化试剂盒和DAB显色剂（福州迈新公司），小牛血清（杭州四季青公司），RPMI1640培基（美国GIBCO公司），鼠抗人Survivin抗体、鼠抗人β-actin抗体、Lipofectamine2000（美国Santa cruz公司），羊抗鼠二抗（美国Invitrogen公司），PTX注射剂（四川太极制药公司），cDDP干粉剂、5-氟尿嘧啶（5-Fu）（山东齐鲁制药厂），长春新碱（VCR）（北京赛科药业公司）。 　　1.3 实验方法 　　1.3.1 免疫组织化学 免疫组织化学染色采用S-P法，具体步骤按照试剂说明书操作。 　　1.3.2 紫杉醇鼻咽癌耐药细胞株的建立 从-80℃冻存罐中取出人鼻咽癌细胞，立即置于37℃的恒温水浴中解冻后，离心，弃上清液。加入10倍体积的培养基，离心，弃上清液，重复用培养基洗涤1次。加入含15%小牛血清的RPMI1640培养基进行复苏，等细胞生长到80%汇合度时，及时进行细胞传代。对传代的细胞进行药物浓度递增法持续诱导，PTX注射剂（规格：5 mL，30 mg/支）。设置不同的浓度梯度：0.1、0.25、0.5、1.0、2.0、4.0、8.0、16.0、32.0 μmol/mL。经过1个月左右的观察和反复实验，本研究发现当浓度为1.0 μmol/mL时，5-8F细胞的死亡细胞占一半左右，同时细胞具有较好的生长，不会造成鼻咽癌细胞的全部死亡，选择1.0 μmol/mL进行持续性筛选1个月后，得到了鼻咽癌PTX的耐药细胞株5-8F-PT