纯系分析对引起奶牛乳头状瘤课件.ppt

奶牛乳头状瘤牛趾皮炎疑似病原的 16sRNA纯系分析与鉴定 主讲：郑利莎 学号：1. 研究背景 牛乳头状瘤牛趾皮炎 Papillomatous digital dermatitis (PDD)是一种牛的足部传染病，在全世界范围内出现，并引起一定的经济损失及动物福利问题。一些研究者的报告表明，在牛趾表皮的表面以及深层组织中均能发现大量的密螺旋体菌属。但是，由于在乳头状瘤牛趾皮炎的病变样本中还含有其他种类的细菌，所以这种疾病的病原学仍未得到明确。 尽管进行了大量的关于乳头状瘤牛趾皮炎细菌病原学的研究，但是几乎所有的方法都使用了培养法和分子生物学方法来确定已知的细菌种类。为了确定乳头状瘤牛趾皮炎病变中的微生物菌群，包括所有未知的和 未培养的微生物。近来，我们使用微生物的16sRNA克隆和序列分析，对来自土壤，口腔，皮肤的样本进行微生物组成的研究。这种无培养方式的使用有助于确定乳头状瘤牛趾皮炎病变中的优势生物体。 2. 材料与方法 2.1. 样本采集 2.2、DNA分离和PCR扩增 样本中的全DNA用超净DNA试剂盒进 行回收提取，然后用两对通用引物对细菌 的16SRNA进行扩增： [1] 27F (5，-AGTTTGATCMTGGCTCAG-3 ，) 1391R (5，-GACGGGCGGTGWGTRCA-3 ，) [2] 27F (5 ， -AGTTTGATCMTGGCTCAG-3 ，) 1492R (5 ， -GMTACCTTGTTACGACTT-3 ，) 2.3 16SRNA的克隆及测序 扩增后的16S RNA片段用DNA连接酶连接到PT7 Blue载体上，倒入大肠杆菌感受态细胞，涂菌，28℃温育两天。挑菌，28.8℃中培养24h。取培养后的肉汤培养基1μL，作为DNA模板，共进行30个循环的扩增，提纯 ，测序，用SEQUENCHER软件来确定16s RNA 全基因核苷酸序列（1500bp） 2.4.系统进化分析法 通过NCBI的BLASTN推导获得大小为1250bp片段的序列，进行系统进化分析数据库鉴定。嵌合序列通过核糖体数据库Ⅱ的嵌合体检测程序鉴定。确定分类群的截止值与克隆体序列的同源性99%。使用CLUSTALW定位16S rRNA的基因序列，通过临近结合方法建立系统发育进化树，用自助再采样(1000平行测定)方法评价，使用TreeView 软件绘制进化树。 3、结果 3.1 克隆体的分布 最终获得1525份克隆体(病变: 836, 正常: 689)。他们的序列同源性为99%，分为316个OTU。病变和正常样本克隆体分别为91和277个OTU，其中的22个OTU在正常样本及病变中都能检测到。 3.2 物种级占优势地位的克隆体 3.3. PDD 优势菌体的系统进化分析 4、讨论 尽管这种疾病准确的病原学还没有得到确定，但从细菌学、分子生物学以及组织病理学的研究显示，牛乳头状瘤牛趾皮炎是一种包括密螺旋体在内的多种细菌引起的传染性疾病. 这里所检测的5份乳头状瘤牛趾皮炎由日本五个不同地方收集来，但是最为主要的克隆体，密螺旋体属和拟杆菌属的细菌在所检测的病变样本中一直存在。而且，病料样本CH1和CH8是由同一牛场的不同的牛采集所得，其时间间隔为1年，比较它们的细菌组成，主要的克隆体几乎相同，这说明与本病有关的细菌群体在同一环境中可能不会改变。 这些研究有力的证明了几种密螺旋体一直存在于该病的病料中，它们之中的任何一种密螺旋体细菌都有可能引起该病。但是现在很难总结这些包括密螺旋体在内的高度流行的细菌是否与牛的乳头状瘤牛趾皮炎的发病机制有关，因为在这项研究中所选用的病变样本的以及正常皮肤组织数量较少。在以后的纯系分析中需要大量的样本，特别是对病变组织与正常皮肤之间的比较。 * *