流式细胞仪分析技术及应用课件_3.ppt

荧光染料与细胞成分的四种结合方式 结构亲和式 嵌入结合 共价键结合 荧光标记抗体特异性结合 免疫荧光标记方法 直标:干扰少,但需购买多种单抗 间标:步骤多,干扰多,不需标记多种抗体 组合标记 （二）免疫荧光标记 免疫胶乳颗粒的应用即液相芯片技术是把微小的乳胶微球分别染成上百种不同的荧光色，把针对不同检测物的乳胶微球混合后再加入待标本，在悬液中与微粒进行特异性地结合，经激光照射后不同待测特产生不同颜色，并可进行定量分析。因检测速度极快，所以又有“液相芯片”之称 。 三、免疫胶乳颗粒技术的应用 微小的乳胶微球分别染成上百种不同的荧光色（固相芯片是用探针在芯片上的坐标位置给基因的特异性编码；而液相芯片则是用颜色来编码） 通过对标记不同荧光素分子的检测，实现FCM对可溶性物质的定量分析 适当的制备方式 处理红细胞 实体组织来源标本用机械法 温度25~37℃，pH7.0~7.2 四、流式细胞免疫学技术的质量控制 （一）单细胞悬液制备的质控 温度 pH 染料浓度 固定剂 （二）细胞悬液免疫荧光染色的质控 光路与流路校正: 确保激光光路与样品流处于正交状态，减少变异（CV）。 PMT（光电倍增管）校准: 保证样品检测时仪器处于最佳灵敏度工作状态。 绝对计数校准: 保证计数的准确性。 Flow-check Flow-set Flow-count （三）仪器操作的质控 同型对照：即免疫荧光标记中的阴性对照，选用相同源性的未标记单抗作为对照调整和设置电压，以保证特异性。 全程质量控制：与待测标本一起标记和检测，结果达靶值，提示本次实验结果可靠。 （四）免疫检测的质控 流式细胞术目前已广泛地被应用于免疫学基础研究和逐步进入临床应用各方面，用流式细胞仪对细胞表面的抗原成分进行标记分析，可区别多种细胞的特性，为细胞免疫的研究增加了有效的手段和帮助。 第四节 流式细胞术在免疫学检验中的应用 T淋巴细胞及其亚群分析 Th(CD3+CD4+CD8-T); Tc(CD3+CD4-CD8+T) B淋巴细胞及其亚群分析 B1(CD19+CD5+):产生IgM型自身抗体, 参与免疫调节、与自身免疫病的发生有关 B2(CD19+CD5-):受外来抗原刺激, 产生高亲和性特异性抗体 NK细胞分析 NK(CD3-CD16+CD56+) 一、淋巴细胞及其亚群的分析 细胞介导细胞毒性试验(死细胞与活细胞比例) 细胞内细胞因子测定 二、淋巴细胞功能分析 三、淋巴造血系统分化抗原及白血病免疫分型 对淋巴瘤和白血病进行多色免疫分型 用于选择化疗方案、判断预后及检出微小残留病变 CD4+Th细胞、CD4+/CD8+比例 MDR(+)表示对化疗药物耐药 四、肿瘤耐药相关蛋白分析 五、艾滋病检测中的应用 HLA-B27可出现在58%～97%的强直性脊椎炎(As) 患者 六、自身免疫病相关HLA抗原分析 七、移植免疫中的应用 FCM作为一个强大的技术平台，已应用于多个领域，其在移植免疫分析中的应用也越来越广泛。目前移植免疫中的FCM应用主要包括流式细胞术的交叉配型（Flow cytometry cross-matching, FCXM）和群体反应性抗体（Panel reactive antibody, PRA）检测。 思考题 流式细胞技术中使用的鞘液主要用于（） A.维持被测细胞的功能 B.维持被测细胞的活性 C.保持被测细胞的形态 D.保持被测细胞处于样本流的中间 E. 保持被测细胞与外部环境pH值相同 2.SS信号主要用于检测细胞的哪一项（） A.表面属性 B.发光效能 C.内部结构 D.外部形态 E.表面分子特征 3.对同一个物体，FS信号的强弱的表达哪项正确（） A.与细胞的体积大小成反比 B.与细胞的体积大小成正比 C.与细胞的自发荧光成反比 D.与细胞的自发荧光成正比 E.与细胞内结构的复杂程度成正比 4.流式细胞仪的数据参数是指仪器采集的用于分析的信号，包括（） A.前向散射光、侧向散射光、速率散射光 B.前向散射光、荧光、侧向散射光 C.侧向散射光、速率散射光、荧光 D.前向散射光、侧向散射光、可见光 E.前向散射光、速率散射光、荧光 思考题 5.用于流式细胞技术分析的细胞必须符合的基本条件是（） A.细胞的pH在正常水平 B.具有生物学活性 C.单个细胞 D.固定后细胞 E.两个或两个以上相连的细胞 6.对工作环境pH变化最敏感的染料是（） A.德克萨斯红 B.FITC C.罗丹明X D.藻红蛋白 E.别藻青蛋白 7.流式细胞仪的光路与流路