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流式抗体及荧光染料的选择PPT课件
流式抗体及荧光染料的选择; 抗原抗体反应;抗原抗体反应
抗原抗体反应的原理
抗原抗体反应的特点
影响抗原抗体反应的因素
;抗原抗体反应:指抗原与相应抗体之间所发生的特异 性结合反应。
抗原与抗体的特异性结合既会在体内发生,亦可以在体外进行,体外进行的抗原抗体反应习惯上称作血清学反应;抗原抗体反应的特点;前带(prezone):抗体过量
后带(postzone):抗原过量
等价带(equivalence zone):
抗原抗体比例合适 ;阶段性
第一阶段:特异性结合阶段,反应快,不可见
第二阶段:反应可见阶段,反应慢,出现凝集、 沉淀和细胞溶解等现象; 影响抗原抗体反应的因素;流式抗体的选择、荧光染料应用;;单克隆抗体
混合单克隆抗体
多克隆抗体;信噪比(S/N):特异性荧光信号(signal)与非特异性荧光信号的比值;综合因素:
荧光标记效率:抗体上标记荧光素的数量(E/P比值)也会影响相对荧光强度。
抗体检测的抗原密度:高密度的抗原几乎可以用任何荧光素标记的抗体检测,而较低表达的抗原则需要用较高S/N比值的荧光素(如PE和APC)标记的抗体检测,从而达到有效区分阳性细胞群和何阴性细胞群的目的。
细胞自发荧光:检测自发荧光水平高的细胞时,使用发射光波长较长的荧光染料(如APC)可以得到较好的S/N比值。;理想荧光素
具有高的光子产量,信号强度高
对激发光有较强的吸收,降低背景信号
激发光谱与发射光谱之间距离较大,减少背景信号的干扰
易与被标记的抗原、抗体或其他生物物质结合而不影响被标记物得特异性
稳定性好,不易受光、温度、标本抗凝剂和固定剂的影响;根据仪器选用荧光素:1.每个通道只能选择1种荧光素
2.各个通道之间的荧光素可以随意搭配
搭配的荧光素之间发射光谱重叠尽量小;注意:
1.不要为了节省荧光抗体,未经过预实验就按抗体说明书减半量甚至更多进行标记。
2.不能完全凭感觉进行标记,需进行细胞计数。
3.应用FITC标记抗体时,避免使用酸性缓冲溶液,因为FITC的荧光特性是pH依赖的。
4.荧光抗体、荧光染色的样本应避免暴露于强光下。
5.建议尽快上机检测(最好24h内)。;Thank You !
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