流式抗体及荧光染料的选择PPT课件.ppt

流式抗体及荧光染料的选择; 抗原抗体反应;抗原抗体反应 抗原抗体反应的原理 抗原抗体反应的特点 影响抗原抗体反应的因素 ;抗原抗体反应:指抗原与相应抗体之间所发生的特异 性结合反应。 抗原与抗体的特异性结合既会在体内发生，亦可以在体外进行，体外进行的抗原抗体反应习惯上称作血清学反应;抗原抗体反应的特点;前带(prezone)：抗体过量 后带(postzone)：抗原过量 等价带(equivalence zone)： 抗原抗体比例合适 ;阶段性 第一阶段：特异性结合阶段，反应快，不可见 第二阶段：反应可见阶段，反应慢，出现凝集、 沉淀和细胞溶解等现象; 影响抗原抗体反应的因素;流式抗体的选择、荧光染料应用;;单克隆抗体 混合单克隆抗体 多克隆抗体;信噪比（S/N）：特异性荧光信号（signal）与非特异性荧光信号的比值;综合因素： 荧光标记效率：抗体上标记荧光素的数量（E/P比值）也会影响相对荧光强度。 抗体检测的抗原密度：高密度的抗原几乎可以用任何荧光素标记的抗体检测，而较低表达的抗原则需要用较高S/N比值的荧光素（如PE和APC）标记的抗体检测，从而达到有效区分阳性细胞群和何阴性细胞群的目的。 细胞自发荧光：检测自发荧光水平高的细胞时，使用发射光波长较长的荧光染料（如APC）可以得到较好的S/N比值。;理想荧光素 具有高的光子产量，信号强度高 对激发光有较强的吸收，降低背景信号 激发光谱与发射光谱之间距离较大，减少背景信号的干扰 易与被标记的抗原、抗体或其他生物物质结合而不影响被标记物得特异性 稳定性好，不易受光、温度、标本抗凝剂和固定剂的影响;根据仪器选用荧光素：1.每个通道只能选择1种荧光素 2.各个通道之间的荧光素可以随意搭配 搭配的荧光素之间发射光谱重叠尽量小;注意： 1.不要为了节省荧光抗体，未经过预实验就按抗体说明书减半量甚至更多进行标记。 2.不能完全凭感觉进行标记，需进行细胞计数。 3.应用FITC标记抗体时，避免使用酸性缓冲溶液，因为FITC的荧光特性是pH依赖的。 4.荧光抗体、荧光染色的样本应避免暴露于强光下。 5.建议尽快上机检测（最好24h内）。;Thank You !