深部真菌感染的实验室检测课件.ppt

深部真菌感染的实验室检测 卫生部北京医院细菌室 胡云建 由于大量使用广谱抗生素，器官移植、导管介入、肿瘤的放疗和化疗、免疫抑制剂的使用等使得真菌的感染呈现上升的趋势。 1983年美国调查念珠菌为第9位血液感染的病原体。然而在美国49家医院的一个三年(1995–1998)对血液感染病原菌监测中发现，只有凝固酶阴性葡萄球菌、金黄色葡萄球菌和肠球菌的发生率高于念珠菌，即念珠菌已成为第4位血液感染的病原菌（见表1）。 表1 美国49家医院1995–1998血液感染病原菌的分布 近年来，还有报道在美国的一些医院真菌感染占阳性血培养的10-15%。同时，真菌感染为艾滋病的重要死亡原因之一。引起深部真菌感染的病原菌主要有白色念珠菌、曲菌和隐球菌等。 由于目前临床大量使用抗真菌药物，不但使感染菌种发生了迁移，而且造成耐药性上升。 作为临床医生应了解当前真菌感染的现状和耐药趋势，以便合理用药。为了更好的治疗真菌感染的病人，现简要地介绍深部真菌感染的实验室检测情况，以供大家参考。 一、培养方法 传统方法：接种沙保弱培养基，阴性结果培养7天。 鉴定：厚膜孢子白色念珠菌 芽管实验白色念珠菌 生化小管 编码鉴定法：API20C, VITEK等 二、非培养方法 （一）、免疫学方法检测真菌感染 近年来，用于检则真菌的抗原、抗体及代谢产物的免疫学检查已用于深部真菌感染的实验室检测，并已成为这一领域研究的热点。目前的免疫学检查主要针对真菌胞壁或胞内成分，但尚无一种方法的敏感性和特异性令人满意，如能结合两种以上方法进行检测，则可明显提高诊断的准确性。  念珠菌 烯醇化酶(Enolase) Cand-Tec抗原 ：Cand-Tec抗原乳胶凝集试验是第一个商品化检测念珠菌抗原的试剂盒（美国，Ramco Laboratories）。该方法的敏感性和特异性分别达到76.5%和87.5%。 β-（1→3）-D-葡聚糖(Glucan) ：目前有日本Seikagaku公司生产的商品试剂盒。（也包括曲菌等） 甘露聚糖(Mannan) ：目前已有Bio-Rad公司生产的商品试剂盒。实验时间为2小时。实验的敏感性和特异性分别达到80%和93%。 隐球菌 荚膜多糖抗原 ：荚膜多糖抗原是隐球菌的荚膜内含特异性的多糖抗原，可用乳胶凝集试验进行检测。目前已有多家公司生产商品乳胶凝集试剂盒，在脑脊液标本检测中使用得较多。 曲霉菌 半乳甘露聚糖(Galactomannan) 半乳甘露聚糖是曲霉菌感染的特异抗原。目前已有的商品试剂盒，例如Bio-Rad公司生产Platelia，实验的敏感性和特异性分别达到93%和95%，但也有文献报告假阳性率高达18%。 （二）、代谢产物检测方法 D-阿拉伯醇可作为侵袭性念珠菌病的诊断标记物，可在病人的血液和尿中检出。检测方法主要有两种：化学分析法和色谱法。实验的敏感性和特异性分别达到70%和86% D-甘露醇是侵袭性曲霉菌和隐球菌的代谢产物之一。但D-甘露醇是否可以作为此两种真菌感染的标记物，有待于进一步的研究。 （三）、分子生物检测方法： 分子生物检测方法目前主要采用PCR法或以PCR法为基础再加上其它方法，如分子杂交、酶免方法、种特异性探针、限制性内切酶、荧光毛细管电泳，即先用真菌通用的引物对临床标本进行扩增，再对扩增产物分析来鉴定是何种真菌，主要用于无菌部位标本的检测。对于其它类型的标本，该方法不能很好区分是感染菌或是定植菌。 三、真菌药敏实验 推荐三种适合医院的临床微生物实验室开展酵母样真菌药敏实验。 抗真菌的试条法（Etest） ATB FUNGUS 2 真菌药敏纸片扩散法 表3 三种药物对念珠菌属的最小抑菌浓度（MIC）结果解释指南 ATB FUNGUS 2 由法国bioMerieux公司生产的ATB FUNGUS 2真菌药敏试剂条，其原理以NCCLS建议标准方法-肉汤稀释法为基础，完成对氟胞嘧啶、两性霉素B、氟康唑和伊曲康唑四大主要抗真菌药物敏感性实验 。 ATB FUNGUS 2 ATB FUNGUS 2 步骤：将准备好的待测酵母菌的悬浮液转移到培养基中，并接种到试条上。在有氧条件下35°C (+ 2°C)的环境中，念珠菌属要培养24小时(+2 小时)，新型隐球菌要培养48小时(+ 6 小时)。 ATB FUNGUS 2 ：读结果 ATB FUNGUS 2 ：读结果 对于两性霉素B，最小抑菌浓度（MIC）应该判断为生长完全