阿司匹林对人慢性粒细胞白血病细胞株K562生长抑制作.docVIP

阿司匹林对人慢性粒细胞白血病细胞株K562生长抑制作 　　摘要为研究阿司匹林对人慢性粒细胞白血病细胞株K562生长的影响，采用光学显微镜和Hoechst 33258染色观察阿司匹林处理后细胞的形态和数目变化，显示阿司匹林促进K562细胞的凋亡.MTT法、细胞计数、软琼脂克隆形成实验、FACS和裸鼠成瘤实验在体外和体内检测阿司匹林对K562细胞增殖和存活的影响，发现阿司匹林明显抑制K562细胞的体外增殖和裸鼠体内成瘤能力.Western blot实验分析细胞信号通道下游基因的表达影响，显示βcatenin、STAT5A、PARP和NFκB p65蛋白的表达量下调，而细胞周期抑制因子p21表达上调.这些结果提示阿司匹林从体外和体内抑制K562细胞的生长，其作用的机制复杂，可能影响βcatenin信号通道、JAK蛋白酪氨酸激酶/STAT5A信号通道、NFκB信号传导通道和细胞周期的进程. 　　关键词阿司匹林；慢性粒细胞白血病；细胞增殖；裸鼠成瘤 　　中图分类号Q78 文献标识码A 文章编2013 　　慢性粒细胞白血病（CML）是一种骨髓造血干细胞恶性增殖的造血系统肿瘤，约占全部白血病的20%左右.90%以上的慢性粒细胞白血病具有Ph染色体和BCRABL染色体易位融合基因的表达，主要表现为白细胞持续升高和脾脏显著肿大[1].CML的病程可分为慢性期、加速期和急变期.目前可能彻底治疗慢性粒细胞白血病的方法是移植造血干细胞，但是可供者来源有限[2]. 常规化学药物和生物制剂IFN治疗的不良反应大.近年来，分子靶向药物酪氨酸激酶抑制剂伊马替尼为数万例CML患者显著延长早慢性期和IFNα治疗失败的晚慢性期.但伊马替尼对于未分化的白血病干细胞无效，容易导致疾病复发且持续治疗费用高[34]. 　　阿司匹林是一种非甾体抗炎药，主要用于解热镇痛、抗炎和抗血小板凝集，预防冠心病、中风等心脑血管疾病发作.近来研究发现长期小剂量服用阿司匹林可以降低多种癌症的发病率[5].阿司匹林显著抑制结肠癌、胰腺癌、肺癌、乳腺癌等多种肿瘤细胞的生长，促进细胞凋亡[69].动物实验证明阿司匹林可以使人结肠肿瘤缩小到15%，而没有任何副作用[10].阿司匹林对慢性粒细胞白血病的治疗研究却少有报道.本研究探讨阿司匹林对人慢性粒细胞白血病K562细胞株的抑制作用，并初步分析可能的分子机制，为白血病的临床治疗提供新的实验依据. 　　1材料和方法 　　1.1材料 　　慢性粒细胞白血病K562细胞株为本实验室保存.3～4周BALb/c品系雌性裸鼠购自湖南斯莱克景达实验动物公司.DMEM培养液、胎牛血清购于GIBCO公司.四甲基偶氮唑盐（MTT）、Hoechst 33258和阿司匹林购于Sigma公司，蛋白质分子质量标准购自Fermentas公司.鼠抗βcatenin、STAT5A、PARP、NFκB p65和p21单克隆抗体购于Santa Cruz公司，鼠抗GAPDH单克隆抗体购于湖南远泰生物公司.Annexin VFITC/PI双染色试剂盒购于美国BD公司.SuperSignal ECL发光试剂盒购于Pierce公司.其他常规试剂均购于上海生工公司. 　　1.2细胞培养 　　人慢性粒细胞白血病K562半悬浮细胞培养于含10%（体积分数）胎牛血清、1667 mkat/L（即105 U/L） 青霉素、1667 mkat/L（即105 U/L）链霉素的DMEM培养液中，置于37 ℃含体积分数为5%CO2的恒温培养箱中培养. 　　1.3K562细胞的形态学观察 　　分别用0、10、20和30 mmol/L 阿司匹林处理的K562细胞培养36 h后， 用普通光学显微镜观察细胞形态并拍照.将余下的细胞离心收集于1.5 mL离心管，加入0.5 mL多聚甲醛（40 g/L），缓缓悬起细胞，固定10 min.用PBS洗2遍.将细胞滴加至载玻片上，尽量使细胞分布均匀.稍晾干，均匀滴上0.5 mL Hoechst 33258染色液，染色5 min.用PBS洗2遍.盖上盖玻片，用荧光显微镜观察细胞核.每组实验重复3次. 　　1.4细胞增殖分析 　　1.4.1MTT法K562细胞在24孔板上培养至对数生长期，分别加入适当的药物处理24 h和48 h.加入50 μL MTT 溶液，继续培养3～4 h后，离心，弃上清，加入二甲基亚砜200 μL，水平漩涡器振荡使结晶完全溶解，测定每孔波长490 nm的吸光值.每组实验设3个复孔，实验重复3次. 　　1.4.2细胞计数法将1×109 个/L的K562细胞接种6孔板中，分别加入0、10、20和30 mmol/L阿司匹林处理24 h和48 h.将细胞用台盼蓝溶液染色，用计数板于低倍显微镜下计算各组细