实验五TB淋巴细胞的分离实验.pptVIP

实验五 T、B淋巴细胞分离试验 山东师范大学生命科学学院 杨桂文 一、实验目的 掌握Ｔ、B淋巴细胞的分离技术 二、实验原理 　　　　淋巴细胞主要分T淋巴细胞和B淋巴细胞两大亚群，它们具有不同的特性和 功能，为此在进行某些免疫学实验时，首先需分离出纯的T淋巴细胞和B淋巴细 胞。本试验的原理为：淋巴细胞与用溴花二氨基异硫氢化物（简称AET）处理 的绵羊红细胞（SRBC）混合后，其中全部T淋巴细胞均能吸附AET—SRBC， 形成牢固稳定而巨大的E—花环，较正常未处理的SRBC形成的E—花环百分比 为高，而且形成快速，不易脱落，重复性好。再经淋巴细胞分层液分离时， AET—E花环易沉于管底，而未形成E—花环的T淋巴细胞，用低渗液解花环周 围的AET—SRBC，便可获得纯T淋巴细胞，而B淋巴细胞可直接取自分层液的 界面。 三、实验材料 新鲜豚鼠血 兔红细胞（RRBC） 溴花二氨基异硫氢化物（AET） 淋巴细胞分层液 其它Hanks液，含小牛血清的199培养液，无菌生理盐水，3.5%氯化钠溶液，离心机等。 四、实验步骤 １．AET—RRBC制备 ① AET溶液的制备：称取AET粉剂402毫克，溶于10毫升蒸馏水 中，使成为0.143M溶液，用4N NaOH溶液调pH9.0。该溶液必须新鲜 配制，不宜久存。 　　②AET处理RRBC：取洗涤好压积的RRBC，按一份压积AET— RRBC加入4份新鲜配制的pH9.0的AET溶液充分混匀置37℃水浴15分 钟，每隔5分钟摇匀一次。取出加冷无菌生理盐水至离心管口（1—2 厘米）1800转/分离心5分钟。连续洗涤3—5次，每洗一次，必须充分 摇匀，以减少AET—RRBC粘附成团，并观察有无溶血。若有溶血现 象，则用含小牛血清的199培养基再洗一次，最后配成10%AET— RRBC悬液，置4℃保存，不得超过5天。 　　③1%AET—RRBC的配制：将预先配制并保存于4℃冰箱的10% 浓度的AET—RRBC，以含10%小牛血清的199培养液稀释至1%。 ２．从新鲜豚鼠血液分离单个核细胞。 　　①取豚鼠抗凝血2毫升，加3毫升Hanks液使之稀释。加于3毫升 淋巴细胞分层液液面之上（沿管壁轻轻加入，勿使两液相混）。 　　②2000转/分离心30分钟，吸淋巴细胞层到另一试管中加5倍体积 的Hanks液洗1—2次，（1500转/分离心10分钟）弃上清即成。 ３．AET—E花环试验 　　将分离的单个核细胞（2ⅹ106/毫升）与等量1%　 AET—RRBC混合，置37℃水浴15分钟，每隔5分钟摇匀 一次，分装数管，每管2—3毫升，低速离心（1000转/分 钟）5分钟后，移至4℃冰箱45分钟。 ４．T淋巴细胞和B淋巴细胞的分离 　　将形成E—花环的细胞悬液，再用淋巴细胞分层液分 离，吸取界面云雾状的细胞，即为富含B淋巴细胞群。沉 淀于管底的E—花环，用Hanks液洗一次后，加双蒸水3毫 升处理3分钟，低渗裂解E—花环周围的RRBC，立即加 3.5%氯化钠溶液1毫升，使还原为等渗，低速离心沉淀，即 得富含T淋巴细胞群。 五、实验报告 写出T、B淋巴细胞分离的详细过程。 分析说明该实验过程中需注意的事项。 * * 用分层液离心后的血细胞层 *