医用分子生物学 讨论课 基因组DNA提取 琼脂糖凝胶电泳 RNA提取PPT课件.ppt

分子生物学讨论课汇报展示 1 2 3 4 5 6 7 8 目录 人类基因组DNA提取 限制性核酸内切酶切割的原理、方法 汇报人： 哺乳动物的一切有核细胞都可以用来制备DNA， 除特殊要求外，白细胞、肝或脾组织是最常用的 材料。原始材料较少或较难获得时（如羊水细 胞），还必须经过细胞培养来获得足够量的细 胞；有时为了简便易行起见，还可以无创伤地采 集材料，如用口腔上皮脱落细胞、发根细胞。产 前诊断所用的材料则为胎儿的羊水细胞或者绒毛 膜细胞 SDS是一种去污剂，破坏细胞膜的脂质 膜； 蛋白酶K是一种很强的蛋白水解酶，能消化各种蛋白质（包括糖蛋白和肽类）及脂类 和胺类物质，但糖蛋白的降解物常与DNA 一同沉淀下来，干扰酶的活性，消化后需 要用酚、氯仿抽提纯化； 人类基因组DNA提取 酚能变性蛋白质而且还能将变性的蛋白质溶解在 其中； （加入1/3体积的饱和NaCl溶液，也可较好地祛除细 胞降解物而纯化DNA，可以避免酚的污染。） 氯仿也是一种有效的蛋白变性剂，它还能促进两 相的分离； DNA上清溶液再经氯仿抽提后用乙醇沉淀，分离 纯化的DNA。 人类基因组DNA提取 人类基因组DNA提取 从全血中提取 1 2 从口腔上皮脱落细胞，发根细胞中提取 人类基因组DNA提取 无水乙醇沉淀时可见白色絮状物 0.8%琼脂糖凝聚电泳可见一基因组DNA条带 OD值测定 人类基因组DNA提取 饱和酚吸取时记得吸取下层的有机相 乙醇沉淀时，要沿离心管壁向DNA溶液中加入无水乙醇，轻轻摇动离心管混合至体系完全均一，见白色絮状DNA 收集细胞的多少是实验成功与否的关键 沉淀中加入1mlSTE后，打散细胞团便于充分消化细胞 人类基因组DNA提取 限制性核酸内切酶切割的原理、方法 限制性核酸内切酶是可以识别特定的核苷酸序列，并在每条链中特定部位 的两个核苷酸之间的磷酸二酯键 进行切割的一类酶，简称限制酶。 限制性核酸内切酶切割的原理、方法 Ⅰ类和Ⅲ类酶在同一蛋白质分子中兼有切割和修饰（甲基化）作用且依赖于ATP的存在。Ⅰ类酶结合于识别位点并随机的切割识别位点不远处的DNA，而Ⅲ类酶在识别位点上切割DNA分子，然后从底物上解离。 Ⅱ类中的限制性内切酶在分子克隆中得到了广泛应用，它们是重组DNA的基础。绝大多数Ⅱ类限制酶识别长度为4至6个核苷酸的回文对称特异核苷酸序列（如EcoRⅠ识别六个核苷酸序列：5- G↓AATTC-3），有少数酶识别更长的序列或简并序列。Ⅱ类酶切割位点在识别序列中，有的在对称轴处切割，产生平末端的DNA片段（如SmaⅠ：5-CCC↓GGG-3）；有的切割位点在对称轴一侧，产生带有单链突出末端的DNA片段称粘性末端。 限制性核酸内切酶切割的原理、方法 限制性核酸内切酶切割的原理、方法 琼脂糖凝胶电泳 结果分析 应用 汇报人： 1、分析条带出现拖尾 原因：蛋白质没有去除干净 2、最下端出现明亮的条带 原因：样本中含有RNA 琼脂糖凝胶电泳结果分析 3、条带的粗细 原因：表明提取出的DNA的多少 4、条带没有出现 原因：1）胶太浓了，DNA跑不进来 2） 最后洗胶的时候冲跑了 琼脂糖凝胶电泳结果分析 琼脂糖凝胶电泳的应用 应 用 人类基因组研究的一个关键应用是通过位置克隆寻找未知生物化学功能的疾病基因。这个方法包括通过患病家族连锁分析来绘制包含这些基因的染色体区域图，然后检查该区域来寻找基因。 琼脂糖凝胶电泳的应用 基因组序列的可用性同样允许疾病基因的旁系同源性的快速识别，对于两个理由是有价值的。首先，旁系同源基因的突变可以引起相关遗传疾病。通过基因组序列使用发现的一个很好的例子是色盲（完全色盲）。CNGA3基因，编码视锥体光感受器环GMP门控通道的a亚单位，显示在一些色盲家系中存在突变体。基因组序列的计算机检索揭示了旁系同源基因编码相应的b亚单位，CNGB3（在EST数据库中没有出现）。CNGB3基因被快速认定为是其他家系的色盲的原因。另一个例子是由早衰1和早衰2基因提供的，它们的突变可能导致Alzheimer疾病的的早期发生。第二个理由是旁系同源体可以提供治疗敢于的机会，例子是在镰刀状细胞疾病或β地中海贫血的个体中试图再次激活胚胎表达的血红蛋白基因，它是由于β-球蛋白基因突变引起的。 琼脂糖凝胶电泳的应用 在过去的世纪里，制药产业很大程度上依赖于有限的药物靶来开发新的治疗手段。最近的纲要列举了483个药物靶被看作