生姜根际姜瘟病拮抗菌的筛选及鉴定.docVIP

生姜根际姜瘟病拮抗菌的筛选及鉴定 摘要：从生姜根际土样分离获得了65个细菌分离物和42个放线菌分离物，通过离体拮抗试验，筛选出对姜瘟病有良好拮抗效果的细菌一株，放线菌两株，编号分别为h16－8、wfl和jw02－6。通过形态学观察、生理生化测定以及16s rdna序列分析，初步确定：h16－8为短短芽孢杆菌(brevibacillus brevis)，wf1为弗雷德氏链霉菌(streptomyces fradiae)，jw02-6为劳伦链霉菌(streptomyces laurentii)。h16-8、wfl和jw02-6的16srdna序列的genbank登录号分别为：eu812754，fj972686和fj972687。 关键词：生姜根际；姜瘟病；拮抗菌；筛选；鉴定 姜瘟病主要是由青枯假单胞菌(pseudomonassolanacearum)引起的。每年6～8月是该病发生和流行的高峰时期，此时北方正值高温高湿天气，是姜块形成膨大旺盛期，病菌易侵入，侵染速度快，严重的可在半月左右造成全田无收，成为制约生姜优质高产的毁灭性病害之一。筛选抗病品种、施用化学农药等措施可防治姜瘟病的发生，但是轮作和筛选抗病品种周期长，使用化学农药不仅不能从根本上防治病原菌，又带来了环境污染。而生物防治既可限制病原菌青枯假单胞菌的生长，又增加了根际有益微生物的数量和抑菌物质的含量，是一种行之有效的方法。目前，虽然已有一些可防治姜瘟病的菌种被发现，但是大多存在着难以在生姜根际长期定殖的问题。 本研究讨论的拮抗菌分离自生姜根际土壤，有利于其在根际的定殖，此外，拮抗菌的应用还可以有效地促进植株的生长。从山东莱芜采集发病区生姜根际土壤样品，筛选到对姜瘟病具有很好生防应用潜力的细菌1株，放线菌2株，其中h16-8被鉴定为短短芽孢杆菌(brevibacillus brevis)，wf1被鉴定为弗雷德氏链霉菌(streptomyces fra-diae)，jw02-6被鉴定为劳伦链霉菌(streptomy-ces laurentii)。 1.材料与方法 1.1材料 生姜根际土壤样品：采集自山东省莱芜市。 供试病原菌：姜瘟病病原菌——青枯假单胞菌(pseudomonas solanacearum)，由山东省莱芜市农业科学研究院提供。 培养基：牛肉膏蛋白胨培养基，高氏一号培养基，马铃薯蔗糖培养基，细菌及放线菌菌种鉴定培养基参见文献[12，13]。 试剂：分子生物学试剂购于宝生物工程(大连)有限公司，dna小量快速纯化试剂盒(3s spinagarose gel dna purification kit)购于上海申能博彩生物科技有限公司。 1.2拮抗菌的筛选 分别采用细菌和放线菌培养所需的不同培养基，通过梯度稀释法，从生姜根际土样中分别获得细菌和放线菌分离物。采用稀释涂布平板法，即取100μl经12h培养的病原菌菌液涂布于拮抗筛选培养基平板上，再将待试菌接种于培养基上，37℃培养24-48h，通过观察抑菌圈的有无及大小进行拮抗活性检测，筛选出对姜瘟病病原菌具拮抗活性的细菌和放线菌，分别记录其编号，并转接到相应分离培养基斜面上保存。 1.3菌种鉴定 形态学特征、生理生化特性检测及16srdna序列的扩增方法见参考文献[13，14]。 1.4dna提取和pcr反应 具体方法参阅文献[15，16]，用相应的液体培养基接种拮抗菌，培养24h，收集菌液提取总dna。 pcr反应体系为：taq dna聚合酶0.5μl，10×buffer(mg2+)2.5μl，dntp(10mmol/l)0.5μl，引物1μl，模板1μl，ddh2o补足至25μl。 反应条件：95℃5min；94℃1min；56℃1min，72℃1.5min，30个循环；72℃延伸10min。 用3s柱离心式琼脂糖dna小量，陕速纯化试剂盒(3s spin agarose gel dna purification kit)纯化pcr产物。 1.5 16s rdna序列测定及分析 16s rdna的测序工作由南京金斯瑞生物科技有限公司完成，序列相似性分析通过ncbi的blast程序比对(http：///blast/)，利用mega4.0软件进行系统发育分析，采用neighbor-joining算法和jukes-cantor模型构建系统发育树。自展次数设定为1000，自展检验结果低于50的数值不显示在图上。 2.结果与分析 2.1拮抗菌的筛选 通过梯度稀释法从生姜根际土壤样品中筛选出65个细菌分离物和42个放线茵分离物。经过初筛及复筛，获得拮抗效果良好且稳定的细菌1株，编号为h16-8；放线菌2株，编号为wf1和jw02-6。 从图1中可以看出，h16-8、wf1和jw02-6都对pseudomonas solanac