酶工程第七章酶分子定向进化20133.ppt

*/138 革兰氏阴性菌表面展示技术 革兰氏阴性菌的外膜蛋白可以与细胞外膜结合 外源基因与革兰氏阴性菌外膜蛋白（LamB、OmpA、PhoE等）基因融合，融合基因表达的融合蛋白可以与细菌外膜结合，展示在细胞表面。 */138 Gram(-) cell display systems : S-layer protein OmpC PhoA OprF OmpA lipoprotein IgA protease Pilin Lpp–OmpA INP Flagella */138 Ice Nucleation Protein (INP) outer membrane protein C （OmpC） */138 periplasm extracellular outer membrane Lpp-OmpA surface display J. Francisco, C. Earhart, G. Georgiou, 1992 Lpp (lipoprotein) signal peptide OmpA (outer membrane protein A) transmembrane domains (1 or 5) Surface protein */138 革兰氏阳性菌表面展示技术 某些抗原蛋白或表面受体蛋白具有锚定到革兰氏阳性菌表面的特性 将外源基因与某些抗原蛋白或表面受体蛋白的基因融合后，其表达的融合蛋白可以展示于细胞表面。 */138 Gram(+) cell Staphylococal Protein A Albumin binding protein 白蛋白结合蛋白 Charged repetitive region 带电重复区域 */138 */138 5、核糖体表面展示法 Ribosome Display，RD 是在体外合成、筛选和展示蛋白质的新技术。 应用于功能蛋白、多肽及酶分子定向进化改造等领域。 基本原理： 通过PCR扩增，获得DNA突变文库，置于具有偶联转录、翻译的系统中，由于翻译到终止密码子mRNA末端后，核糖体仍停留在mRNA的3’端而不脱离，使目的基因的翻译产物展示在核糖体表面，形成“mRNA一蛋白质一核糖体”的三元复合物，将基因型和表现型直接偶联起来，利用免疫学检测技术对复合体进行分析和筛选。 */138 */138 第三节 酶分子定向进化的应用 酶分子定向进化的特点： 适应面广：P酶、R酶 目的性强：人工控制条件筛选 效果显著：能在短时间内获得自然界需要长时间完成的进化。 */138 某些酶定向进化结果 目标酶 所需功能 方法 结果 实施菌种 卡那霉素核苷基转移酶 热稳定性 定位诱变+选择 在60-50℃酶半衰期增加200倍 耐热脂肪芽孢杆菌 枯草杆菌蛋白酶 作用于有机溶剂 易错PCR+选择 在60％二甲基亚砜中活力增强170倍 枯草杆菌 β-内酰胺酶 作用于新底物 DNA改组+选择 对cefotaxime的抗性增加32000倍 大肠杆菌 对硝基苯酯酶 有机溶剂中的底物特异性和活性 易错PCR+重组 活力增加60-150倍 大肠杆菌 胸苷激酶 第五特异性 基因理疗 交错延伸+选择 活力增加43倍 大肠杆菌 β-半乳糖苷酶 底物特异性 DNA改组+选择 活力增加66倍底物特异性增加1000倍 大肠杆菌 砷酸脱毒途径 砷酸抗性 DNA改组+选择 抗性增加12倍 大肠杆菌 */138 一、提高酶的催化活性 是定向进化的主要目标之一 例如： 1993年陈等人提高枯草杆菌蛋白酶E在有机溶剂中的催化效率（157倍） 1994年Stermer使β-内酰胺酶催化活性提高32000倍 1992年Beaudry等使四膜虫RNA剪切酶提高100倍 */138 二、增强酶的稳定性 提高酶稳定性的方法： 分子修饰 固定化 非水相介质催化 定向进化 */138 枯草杆菌蛋白酶E热稳定性的分子进化 最适温度提高17℃，65℃的半衰期延长50-200倍 */138 三、改变酶的底物特异性 影响酶对底物的Km值，进而改变底物特异性 例如： 2000年，Aharoni等采用基因家族重排技术将大肠杆菌碱性磷酸酶对有机磷酸酯的特异性提高2000倍 2005年，冯志勇等采用易错PCR技术使β-糖苷酶失去原有的催化糖苷水解的活性，而呈现糖基转移酶的活性 2002年，Bartel使RNA剪切酶失去催化RNA分子剪切反应的特性，而呈现出将RNA和多肽链拼接在一起的催化特性。 */138 */138 思考题 P173 Figure 2. Diagram of DNA shuffling. First, the parental sequences are randomly fragmented b