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* * 亲和免疫组化技术 (Affinity cytochemistry﹠histochemistry technique) 亲和的概念 物质之间具有的高度结合力，包括抗原与抗体、生物素与抗生物素（又称亲和素）、葡萄球菌A蛋白与IgG、植物凝集素与糖类、阳离子与阴离子、激素与受体之间的结合反应等。 第一节 生物素－亲和素免疫细胞化学技术 一、基本原理 （一）生物素（Biotin）与亲和素/卵白素/抗生物素（Avidin/anti-Biotin）之间有很强的亲和力 ； （二）生物素和亲和素具有与其它示踪物质如荧光素和过氧化物酶等相结合的能力 。 二、几种经典的抗生物素－生物素染色法 （一） ABC（Avidin Biotin-peroxidase Complex ）技术 （二）LAB（Labelled Avidin-Biotin ）技术 （三） LSAB（labeled streptavidin biotin method ）： S-P（ streptavidin －peroxidase）技术 ? SABC （streptavidin-biotin complex） 技术 （四）BRAB（Bridged Avidin-Biotin ）技术 （五）CSA（Catalyzed signal amplification）法 （六） Envision技术 （一）亲和素-生物素-过氧化物酶 （Avidin Biotin-peroxidase Complex，ABC）技术 1．基本原理 2、操作步骤 （1）石蜡切片常规脱蜡至水，冰冻切片经冷丙酮固定，用PBS洗； （2）用3% H2O2甲醇液室温作用20min后，充分水洗 ； （3）PBS洗，加牛血清白蛋白或二抗动物种属正常血清15min ； （4） 加第一抗体（即用型或浓缩型）4℃过夜或37℃ 1h ； （5）PBS洗，加生物素化第二抗体37℃ 30min ； （6）PBS洗，加ABC复合物（1∶100,使用前30min将等量的亲和素 和酶标生物素 混合，稀释配制成 ABC复合物 ), 37℃ 20min ； （7）PBS洗，经DAB/H2O2显色 ； （8）常规脱水，透明，中性树胶封固。 3、ABC法的优点 （1）敏感性高 :结合力强,分子量小; （2）特异性强，背景染色淡 ； （3）方法简便，节约时间 ； （4）由于生物素与抗生物素具有与多种标记物结合的能力，可用于双重或多重免疫染色 。 （二）标记生物素-抗生物素技术 （Labelled Avidin-Biotin Technique, LAB技术） 1、基本原理 以生物素标记抗体作第一抗体，酶标记抗生物素作为第二抗体，同S-P技术 LAB法示意图 2、操作步骤 （1）①-④ 步骤与ABC法相同 ； （5）PBS洗后加生物素标记第一抗体37℃ 30min ； （6）PBS洗后加酶标亲和素 （如HRP-Avidin） 37℃ 30min： （7）以下步骤同ABC法。 （三） LSAB（labeled streptavidin biotin ）技术： S-P （ streptavidin －peroxidase）技术 SABC （streptavidin-biotin complex）技术 1、基本原理 2、操作步骤 （1）常规切片脱蜡至水 ； （2）必要时抗原修复：如高温高压修复； （3）3% H2Ｏ2甲醇液阻断内源性过氧化物酶15min ； （4）水洗，PBS洗， 10%牛血清白蛋白20min ； （5）加一抗 4℃过夜或37℃孵育1h ； （6）PBS洗，滴加生物素化的二抗37℃ 30min ； （7） PBS洗，滴加HRP标记链霉亲和素（S-P复合物）或链霉亲和素－生物素 （SABC），37℃ 孵育20min ； （8）DAB/H2Ｏ2显色， 常规脱水、透明、中性树胶封固。 （四）BRAB（Bridged Avidin-Biotin ）技术 1、原理 以生物素标记抗体作第一抗体，抗生物素作为第二抗体，桥接酶标生物素。 2、操作步骤 （1）①-③ 步骤与ABC法操作相同； （2） 加一抗4℃过夜或37℃ 1h； （3） PBS洗后加生物素标记的第二抗体 37℃ 30min；（4） PBS洗后加亲和素 37℃ 孵育30min； （5） PBS洗后加HRP酶标记生物素37℃ 30min； （6）