实用组织化学技术常规病理组织学和组织化学研究生 张国华 20160504 w3 ppt课件.ppt

④APES粘片剂（Vectabong试剂） （3-Amino propyltriethoxy silane） 是一种新型玻片粘附剂，通过对玻璃表面的化学修饰作用，改变其表面的化学物理特性，使组织切片牢固地粘贴于玻璃片上，贴上后不易脱落，保留时间较久。一个试剂盒7ml可配成350ml（丙酮）工作液。 程序：干净载玻片→丙酮5min→ APES(1ml+50ml丙酮），将玻片用镊子夹住浸入APES试剂1-2次→纯丙酮洗2次→干燥，37℃过夜→用铝箔包好，RT存放，备用。 ⑤铬矾明胶液（略） ⑥甲醛-明胶液（略） 注意：①备用载玻片均要避免污染（尤其注意防尘）； ②一般可保存半年以上。 2、制作切片 需要的工具：切片刀、磨切机、水浴锅、干燥箱或烤片机（可用蜡箱代替使用）。还需载玻片、手术刀、毛笔一支、弯镊子一个、托盘一个、大平皿一个、（展片使用）烤片盒或烤片架、蛋白甘油等。 切片机： 1. 切片机种类：有轮转式切片机，滑行式切片机（滑动式），冰冻切片机，超薄切片机（电镜用）等； 2. 构造：任何一个类型的切片机都是由四个基本部分组成： ①刀台；②标本台；③旋转轮；④控制切片厚度的微动装置（标有 l—25或1一50的数字，每一数字代表一个微米用μ来显示）。可根据需要厚度来调节，一般组织片都采用7μ。 以上四部分共装在一个铁制的台坐上，这样就组成了各种类型的切片机，最常用的是石蜡切片机。 切片操作： ⑴．将切割修整好的蜡块用普通刀片先将蜡块切面暴露出来、修平，固定在切片机标本台上并拧紧螺旋。 ⑵．切片刀固定于刀台上，拧紧固定刀的螺丝，同时调整刀与蜡块的切片距离，使刀与蜡块贴紧后再固定刀台螺丝，刀的角度为25度角。 ⑶．调节微动装置，调至切片所需厚度（一般为 6-7微米） ⑷．修材。右手握旋转轮摇把，按顺时针方向均匀地摇动直到组织块切面完整为止。如果以上各部操作正常，此时能切出一条完整的连续的蜡带，用毛笔轻轻将蜡带顺刀口挑下，放在托盘内待用。 3、水浴锅展片、捞片 通电后将平皿内水温升至45℃左右，将已切好的薄片切割数片轻漂水中展平，不平时可用小弯镊子轻轻展平，然后用涂有蛋白甘油等粘附剂的载片在水中选择完整的切片以一定角度进行捞片。 注意事项： 1．切片刀要锋利，否则切片有切痕或组织破碎，甚至切不下来。 2．展切片时水温要适当，水温低展不平切片，影响效果，有皱折；水温过高切片入水后蜡片及组织熔化。 八、染色 染色前准备工作 染色用的工具： 12个染色缸或者盛各种不同浓度的酒精染色筐广口瓶，染色缸及脱蜡、透明用的各二个二甲苯缸，盖片，带磨口盖的树胶瓶一个，镊子等。 染色需要的试剂及染色液的配制： ①盐酸—酒精：主要是染色分色时用。一般采用0. 5—1％的浓度，即在100ml的70％—80％酒精中加人0.5或者1ml的浓盐酸。 ② 苏木素（Hematoxylin） 苏木素为细胞核的染料，不经氧化的苏木素是不具有染色能力的。苏木素的配方很多，一般组织化学染色所配制的苏木素有二类：一类是自然氧化的苏木素，另一类是加入氧化剂加速氧化的苏木素。 ③伊红（曙红， Eosin） 是细胞质最常用的染料之一。外观是红色粉末。分两种，一种是酒溶性伊红，另一种为水溶性伊红。使用前要看说明以免配错。 一般组织病理学切片染色，染细胞核用苏木素，染细胞质用伊红，故称之为HE染色（苏木素-伊红染色法）。 染色方法及步骤（以HE染色为例） 1．脱蜡，将干燥的切片入二甲苯I 10-20分钟，然后移入二甲苯Ⅱ 10-20分钟。 2．脱苯：用无水乙醇I 脱苯2-5分钟，再经无水乙醇II 2-5分钟。 3．水化：再经95％→90％→80％→70％酒精各1分钟，入蒸馏水浸洗数分钟，每步操作要轻。 4．染细胞核，将切片移入苏木素染液中染10-20分钟。 5．水洗（水洗一下，将浮在表面的染液去掉）。 6．l％盐酸酒精分化，时间几秒钟，肉眼观察切片组织材料呈粉红色即可。 7．兰化：水道流水洗（半小时-24小时），切片从粉红色转变为鲜艳的兰色，这过程也称为兰化的过程。必要时放入氨水的低碱液中浸几分钟。 8．染细胞质：用0.5％或者l％伊红水溶液进行染色，1-5分钟。 9．切片脱水：是由低浓度酒精到高浓度酒精。 将切片入70％→80％→90％→95％酒精，时间几秒钟，时间长了，伊红易脱色，注意伊红与苏木素的对比染色的色调适合。 10．彻底脱水，100％酒精I 5—10分钟，再入100％II酒精 5—10分钟。 11. 透明：入二甲苯I 2—5分钟，再入二甲苯II 2—5分钟。 实用组织化学技术 中国医科大学法医学院 张国华 细胞化学和组织化学 cytochemistry and histochemistry 是以细胞学、组织学为基础，运用物理的和化学的技术方法显示细胞组