【抗生素精品课件】D－氨基酸氧化酶基因工程菌诱导发酵实验.ppt

D－氨基酸氧化酶基因工程菌诱导发酵实验 一、选题的意义两步酶法合成7-ACA的研究 两步酶法合成7-ACA，是指头孢菌素C（CPC）首先在DAO的催化下氧化脱羧反应生成戊二酰-7ACA(GL-7ACA)，GL-7ACA再由GA催化，脱酰基生成7-ACA。整个过程的流程参见Fig.1。因此，两步酶法转化CPC合成7-ACA的研究，离不开对DAO和GA的研究。 意义 半合成头孢类抗生素，是类高效、广谱性抗生素，被广泛应用于治疗细菌感染。具资料统计，以青霉素和头孢菌素为代表的Beta-内酰胺类抗生素，销售额已占临床抗生素世界销售总额的70%左右，前者占20%，后者占52%。由于在世界范围内，对半合成头孢菌素类抗生素的广泛需求，致使医药市场上对合成头孢类抗生素的前体——7-氨基头孢烷酸（7-ACA）的需求量持续增长。 D－氨基酸氧化酶的研究进展 DAO是一种黄素腺嘌呤二核苷酸为辅基典型的黄素蛋白酶，它是由两个相同的亚基与一分子FAD螯合在一起形成的有功能的蛋白质。 DAO作用于CPC的7位D型a-氨基己二酰側链，催化CPC氧化脱氨形成过氧化氢和a-酮基己二酰-7ACA，AKA-7ACA再被过氧化氢氧化脱羧生成GL-7ACA。次后，由于GA的发现，应用该酶可将GL-7ACA进一步酶促水解而得到7-ACA，DAO是这些反应的第一个酶，它在工业生产中的重要性进一步被认识。 DAO基因的表达的研究 DAO在大肠杆菌中表达，需IPTG或乳糖诱导，胞内表达。优点是发酵周期短 18－20h。 在毕赤酵母表达DAO，组成型的分泌表达。避免过氧化氢酶的影响。 Fig3.Expression of dao gene in E.coli induced with IPTG Lane1,2 The precipitation of 6-His-N ; Lane3, The precipitation of 2-His-N ; Lane4, The precipitation of 6-His-C ; Lane 5 The supernatantof 6-His-N ; Lane 6The supernatantof 2-His-N ; Lane 7 The supernatantof 6-His-C ; 三、 His-Tag亲和柱纯化D-氨基酸氧化酶 收集菌体40g加入pH7.0,30ml 磷酸 buffer, 用French pressure cell press， 1000psi的压力下压榨细胞两次, 离心取上清加入 5g Co-Agarose， 10oC,160rpm振摇24h, 装柱然后用50 -100 倍柱床体积的 Wash buffer 流洗柱1ml/min，直到洗出液OD595小于0.06, 然后用Elution buffer 洗脱流速为0.5 ml/min, 得到的酶液直接用于固定化。酶的回收率为36.2％。纯度为99.1%。 1. 发酵过程中菌生长曲线 2. 发酵过程中产酶曲线 * * Fig.1 Enzymetic conversion of cephalosporsion CPC to 7-ACA 三、His-Tag亲和柱纯化D-氨基酸氧化酶 收集菌体40g加入pH7.0,30ml 磷酸 buffer, 用French pressure cell press，1000psi的压力下压榨细胞两次, 离心取上清加入5g Co-Agarose，10oC,160rpm振摇24h, 装柱然后用50-100倍柱床体积的Wash buffer流洗柱1ml/min，直到洗出液OD595小于0.06, 然后用Elution buffer 洗脱流速为0.5 ml/min, 得到的酶液直接用于固定化。酶活的回收率为36.2％。纯度为99.1%。 Fig.4 SDS PAGE of pure Dao 1-3ml; 2-6ml; 3-9ml; 4-12ml; 5-15ml; 6-18ml Fig.1. The curve of growth Fig.2. The effect of fermentation time on DAAO activity