分子生物学和基因打靶实验讲义.docVIP

分子生物学与基因打靶 实验技术培训讲义 中山大学药学院 微生物与生化制药实验室 2005-05-30 DCS3检测试剂盒 勿需精良设备、高昂费用 现在，基层医院也可方便的进行淋巴细胞亚类检测 【由中山大学和广州润兴生物科技有限公司联合开发的单克隆抗体DCS3检测试剂盒，不需要流式细胞仪，直接利用外周血染色，显微镜下即可进行T细胞计数。】 【DCS3使普检时方便、快捷检查T细胞亚群，以及全国数量众多的中小卫生院在现有条件下进行T细胞亚群检测成为可能。】 DCS3试剂盒检测T细胞亚群的优点—— ◆不需要昂贵的流式细胞仪，操作简便、快捷、高效。 ◆ 准确灵敏、抗干扰，易于观察计数。 测定结果具有可靠的临床意义，可作为药物治疗、免疫机能评价的依据。 1.分子生物学基本实验技术 1.1酚抽提法制备哺乳动物基因组DNA及其定量 1.1.1从哺乳动物的细胞和组织中分离DNA的四种常用方法： (1) Bin 和 Siafford（1976）根据Gross－Bellard等（l973）所提出的原始方案改进而成，利用蛋白酶K、SDS和酚，所获DNA的大小（100－150kb）适用于在(噬菌体载体上构建基因组DNA文库。 (2) 包括用蛋白酶K消化、用高浓度甲酰胺使DNA－蛋白质复合物解离，以及通过火棉胶袋透析除去残存的蛋白酶K等步骤（Kupiec等，1987）。该方法较第一种方法费时，但省去了有机溶剂抽提的费力步骤，由于DNA未经振摇，不通过移液管，也不经过乙醇沉淀，故其分子量非常大，不过最终获得的DNA通常浓度颇低（约10(g／ml）。 (3) 用盐酸胍裂解细胞，所生成的DNA较小（约80Kb），然而该方法非常快捷并可用来同时从不同的细胞或组织中抽提DNA（Bowieli，1987）。这一方法制备的DNA尽管不能应用于构建基因组DNA文库，但用于Southern杂交和PCR模板则效果极佳。 (4) 使用试剂盒,这种方法省时，步骤少，但所生成的DNA较小（约80Kb）适用于Southern杂交和PCR模板。尤其方便微量组织或血液DNA提取。 原 理 抽提DNA片段大小 适 用 优缺点 酚抽提法 SDS等温和破碎细胞 100—150Kb 构建λ噬菌体库 通用方法 蛋白酶K 消化后用酚抽提 甲酰胺解聚法 甲酰胺解聚蛋白质与DNA的 200 Kb 构建粘粒文库 DNA提取物大 结合,再透析处理小分子物质 浓度较低,费时, 其余同上. 少量RNA污染 盐酸胍法 用盐酸胍将细胞破碎使蛋白 80 Kb Southern杂交 快速简便但片段 质与DNA分离,乙醇沉淀. PCR模板 较小 RAPD AFLP RFLP 胞核DNA提取法 先制备细胞核,然后从中制备 100-150 Kb 构建λ噬菌体库 DNA提取物分子 DNA 较大,纯度高,但 操作烦琐费时 试剂盒法 通过将DNA吸附到spin柱和 40-50 Kb PCR Southern杂交 省时,1小时完 洗脱来纯化DNA RAPD AFLP RFLP 成,纯度较好. 1.1.2 试剂： (1) DNA抽提缓冲液：(10mmol/L Tris-Hcl,50mmol/L EDTA, 100 mmol/L NaCl, 0.5% S