蛋白质、氨基酸类化合物的定量分析(蒸馏法).pptVIP

三、蒸馏法（经典凯氏定氮法） ［测定原理］ 蒸馏法就是在消化液中加入强碱，使在消化过程中固定在（NH4）2SO4中的蛋白质的氮以NH３的形式释放，并以加热蒸馏的方式使其脱离消化体系，用标准酸吸收；然后，用标准碱滴定剩余的标准酸，以此计算出样品中的蛋白质的相对含量。测定原理反应方程如下： （NH4）2SO4+NaOH=NH4OH+Na2SO4 NH4OH → H2O + NH3 NH3+(标准) H2SO4→（NH4）2SO4 (标准) H2SO4+NAOH→Na2SO4+H2O 三、蒸馏法（经典凯氏定氮法） 原理示意： 1．蒸汽发生器； 2．反应瓶； 3．冷凝器； 4．吸收瓶（内含标准酸）。 ［方法分类］ 依样品用量的不同和蒸馏设备的差异，此类方法可有常量、微量和半微量之分。各种定氮法的范围为： 常量法：40mg； 半微量：3～5mg； 微量：0.5～1mg ［仪器］ ⒈凯氏烧瓶 ⒉凯氏定氮仪 从原理上讲实际上就是水蒸汽蒸馏设备。常量定氮法只需一个定氮球即可；半微量及微量定氮法需专门的定氮仪。而微量定氮仪又可分一般的定氮仪 ── 水蒸汽发生器、反应器三部分构成；还有改良式的微量定氮仪，即将上述三部分组合为一体，仪器使用起来比较方便，但容易损坏，适用于固定场合的常规分析，学校不宜采用这种类型的玻璃仪器。 ⒊微量滴定管 ［试剂］ 1 ．消化试剂 包括硫酸铜、硫酸钾、浓硫酸。 2 ． 40％氢氧化钠 用于促使反应器中的铵态氮转化为氨态氮，以利于在蒸馏时侵分解为氨气，并从消化体系中分离。 3．2%硼酸吸收液 4．指示剂 （1）0.01％甲基红乙醇溶液； （2）0.01％溴甲酚绿乙醇液。两者临用时按1:5的比例混合。 5．0.01N盐酸标准液 用于滴定（中和）硼酸吸收氨形成的硼酸铵 ── “弱碱”。 ［测定操作］ 1．消化 精称固体样品0.2～2.0克（半固体样品2～5克、液体样品10～20ml）移入干燥的定氮瓶中，向定氮瓶中加0.2克CuSO4、3克K2SO、10ml浓硫酸，瓶口放一个小漏斗，置定氮瓶于电炉上倾斜40度固定，先小火后大火消化。（注意固态样品的转移方式） 2．定容 向冷却后的定氮瓶中加20ml蒸馏水稀释消化液，促进硫酸的潜热释放。冷却后，把消化液小心地移入100ml容量瓶中，再用蒸馏水把定氮瓶洗刷次，洗刷过的水也移入容量瓶。再冷却后*，用无氨蒸馏水定容至刻度，以备蒸馏。 ［测定操作］ 3．蒸馏 按图示的定氮蒸馏设备组装仪器。 ①蒸汽发生器： 水位保持水量为瓶容的2/3，加甲基红、硫酸数滴以使水溶液呈现酸性。这一处理的目的在于防止蒸馏用水中存在游离氨干扰定氮。 另外，在发生器中放置一些碎碴或小型短磁管构成沸腾中心，避免在蒸馏时产生爆沸。 ②吸收瓶： 加入25ml2%硼酸H3BO3Ｉ液及2滴混合指示剂。把冷凝管出液端管口插入吸收液液面以下。 ［测定操作］ 3．蒸馏 ③反应器（反应室） 吸取10.00ml样品消化稀释液，由进样漏斗加入反应室，然后用少量水冲洗漏斗，并放入反应室。再从进样口加入10ml 40%NaOH进入反应室，立即加塞并加水密封。 从第一滴馏液滴下开始计时，蒸馏5分钟，移动吸收瓶，使冷凝下端口离开液面，再蒸馏一分钟，用少量无氨水冲洗冷凝管下端口外部，停止蒸馏。取下吸收瓶，用标准酸滴定。 上述操作需进行3～4次，而每次平行实验的蒸馏结束均应对蒸馏仪作蒸馏清洗处理。 ⒋滴定 用 0.01N盐酸标准液测定蒸馏吸收液至终点 ── 即反应液由蓝绿色转为灰紫色（有的称其为灰红色）。 空白试验 用无蒸馏水代替等重的样品按上述步聚（消化、蒸馏、定容、定氮）操作，其目的在于消除整个测定过程中非样品体系所带来的游离氨的干扰。 ［计算］ 吸收氨消耗的标准酸（ml）＝V样 －V空 折算为蛋白质量（克） ＝吸收氨消耗的标准酸 * 0.014 * F 0.014：每毫克当量的N的克重量； F：测试样品对应的氮系数 （氮含量的倒数） ［方法的要求］ 试验用水，采用无氨蒸馏水。其可用下列方法制备：在玻璃蒸馏瓶中加入普通蒸馏水，再加数ml滴浓硫酸使其呈现酸性，然后蒸馏，收集的馏即分为无氨蒸馏水。 *本校试验用水说明 ［方法的特点］ 1．准确、为仲栽分析法； 2．测定的周期长。 ［方法的用途］ 1．测定蛋白质、核酸或其它含氮化合物的含量； 2．可用此方法对分光光度法作标准样测定。 ［蒸馏仪的使用问题］ 1 ．清洗 使用前或每次蒸馏平行实验后，均要用蒸汽做清洗：即向反应室中加水，然后蒸汽清洗数次。标准：用吸收液（加指示剂）接收馏分后不变色。 2 ．各开关的操纵 （1）进样时：进汽、排汽阀门都打开； （2）蒸馏时：进汽门开、排汽阀门关