半定量RTPCR在检测基因表达量中的应用课件.ppt

半定量RT-PCR在检测基因表达量中的应用 汇报人：周立敬 指导老师：周宜君 主要内容 半定量RT-PCR简介 半定量RT-PCR流程 1.提取组织总RNA 2.合成反转录cDNA第一链 3.优化PCR反应体系 4.凝胶电泳及凝胶成像和定量分析 半定量RT-PCR应用 一.半定量RT-PCR简介 半定量反转录－聚合酶链反应（SqRT-PCR） semi-quantitative reverse transcription and polymerase Chain reaction 原理：通过mRNA反转录成cDNA，再进行PCR扩增，并测定PCR产物的数量，可以推测样品中特异mRNA的相对数量。 对试验条件的要求不高， 费用低、普通实验室容易做到而被经常使用。 二.半定量RT-PCR流程 1.提取组织总RNA 存在问题：RNA酶的广泛存在性和难降解性 解决方法：枪头，离心管用0.1%DEPC水处理； 研钵180℃烘烤2h。 RNA质量检测：吸光度值OD260 /OD280的值在 1.8-2.0之间（纯度高）；1%琼脂糖凝胶电泳检测， EB染 色, 紫外光下观察RNA, 如果能够清楚的看见28S、18S 和5S 3条带。 二.半定量RT-PCR流程 2.合成反转录cDNA第一链 不同样本所取的总RNA必须要等量，且大于1μg，保证待检测mRNA的量不会受外界因素影响。 二.半定量RT-PCR流程 3.优化PCR反应体系 引物的设计和选择 DNAMAN；primer premier 5 内标的选择（选取各种条件下表达水平稳定、表达量适中的看家基因作内对照） β-actin；GADPH；18SrRNA；Tubulin 3.优化PCR反应体系 循环数确定 由于扩增效率及平台期的问题,必须确定待检测基因与内标基因达到平台期前扩增效率最大的循环数。 二.半定量RT-PCR流程 4.凝胶电泳及凝胶成像和定量分析 琼脂糖凝胶电泳 在凝胶电泳成像系统下拍照 quantity one分析光密度确定基因表达量 三.半定量RT-PCR应用 盐芥基因表达谱研究 盐芥根：CK和T(300mmol NaCl处理72h) 引物序列见下张幻灯片。 内参：Tubulin，大小为700bp 循环数：25 循环数的选取 Tubulin的电泳图 上调基因的电泳图 上调基因的电泳图 1号，大小379bp，57℃ 下调基因的电泳图 Quantity one分析 研究进展 李亚青等利用RT-PCR 法检测在盐、ABA、冷胁迫下TaGSK1 基因的表达,结果表明,该基因在这几种胁迫下的表达均有提高,说明TaGSK1 基因在对抗盐、ABA 和冷逆境胁迫信号通路中具有重要作用。 王迪等使用半定量RT-PCR 的方法，研究了miR393 在旱处理后的孕穗期水稻叶片和穗部的表达情况。结果发现，miR393 在胁迫后的叶片和穗部表达上调。同时也发现，miR393 在胁迫前后穗部的表达略高于其在叶片中的表达。实验结果也表明，半定量RT-PCR 适用于分析miRNAs 的表达。 半定量RT-PCR原理 * * 因为根部对于胁迫的反应比其他器官如叶片等更快、更灵敏;而且提取根部RNA 时,较少受到多糖、脂质及酚类物质等杂质的影响,提取的RNA 质量高,有利于下一步的反转录反应。另外,所取的小麦根的量要尽量接近一致,这样有利于调节模板cDNA 的量,使内参的扩增产物量一致 TACAGTGGTCACGGCAGAAATAAAA AT1G01720 R TTGTGCGTTTATGGTAACACGAGAC AT1G01720 F 2号 ACGGTTCTAAGTCTGAAAAGTCGCT E3539 R GTCCTGCTCAGTGTCCAGATGTAAC At5g58070 R AGGGAGAGATCATGGCGGCA E3539 F AGAAAGAGATGTAAGTGGTGAAGGG At5g58070 F 1号 TGGTGTGGAATGAAACATCAGTAC At3g01280 R TCAGGCATGATTAAGAGCACTAGTC TH935 R ACAAGGACCACAATAGCGACC At3g01280 F 8号 TACCGTTGGTTGTTTATGGCTTAGT TH935 F AAAACGGGAACACACACTTGCTT