基于26S rDNA D1D3区序列分析的鸡血藤及其混淆品的分子鉴别.docVIP

　　基于26S rDNA D1D3区序列分析的鸡血藤及其混淆品的分子鉴别 作者：安冉,杨锦芬,刘军民,翟明,徐鸿华 【摘要】 【目的】利用26S rDNA D1D3区序列差异鉴别鸡血藤及其混淆品。【方法】使用改良十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)法提取鸡血藤及其混淆品的总DNA,选择浓度较高的样品作为模板DNA,对26S rDNA D1D3区进行PCR扩增、测序和序列比对分析。【结果】获得26S rDNA D1D3区长约700 bp的序列。比对结果显示,不同产地之间鸡血藤的序列一致率为96%和100%,混淆品与正品比较的序列一致率为80%～96%。在26S rDNA D1D3区384～472 bp的位置有足够的碱基差异位点用以区分鸡血藤及其混淆品。【结论】26S rDNA D1D3区序列可以应用于鉴别鸡血藤及其混淆品。 【关键词】 鸡血藤;序列分析，DNA 　鸡血藤为豆科植物密花豆Spatholobus suberectus Dunn的干燥藤茎,其性温,味苦、甘, 归肝、肾经, 有补血、活血、通络的功效, 用于治疗月经不调、血虚萎黄、风湿痹痛等症[1]。商品鸡血藤药材基源植物除《中国药典》收载的密花豆外,还有豆科、五味子科、木通科等共6个属15种和变种的植物,如常春油麻藤、香花崖豆藤等[2]。由于商品鸡血藤的来源复杂,临床中常出现混用现象。目前,对鸡血藤类药材的鉴别,多以传统鉴别方法为主,但这不足以简便、准确地鉴别其真伪。植物基因的26S rDNA D1D3区中包含一个序列变异快的D2区可用于鉴别不同的植物,两端又有保守区域可供设计通用PCR引物,且该区域具有长短适宜,便于扩增、测序和比对的特点[3],因此,本研究选用26S rDNA D1D3区对鸡血藤及其混淆品进行DNA序列分析,旨在为鸡血藤种质评价与鉴定提供分子鉴别的依据,现报道如下。 　　1材料与方法 　　11药材实验所用的鸡血藤及其混淆品(见表1)采自我国鸡血藤主产区：广东、广西省区的野外及广州中医药大学三元里药圃,经广州中医药大学徐鸿华教授鉴定并确定其拉丁学名。分别采集幼嫩叶片,装于密封塑料袋内,用变色硅胶干燥,置于-20冰箱保存,备用。表1鸡血藤及其混淆品的产地来源 　　12试剂及仪器Tris购自Salandchem International Inc,十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)和聚乙烯吡咯烷酮(PVP)均购自上海伯奥生物技术公司,乙二胺四乙酸(EDTA)购自天津福晨化学试剂厂,PCR试剂、DNA marker购自大连宝生物技术公司,PCR产物纯化试剂盒购自北京赛百盛基因技术公司,引物由上海生工生物工程技术公司合成,PTC200型 PCR仪(美国Biorad公司),DYCP31水平电泳仪(北京六一仪器厂),Infinity 1000/26M凝胶成像及分析系统(法国Vilber Lourmat公司)。 　　13总DNA的提取采用CTAB法[4]并加以改良。取01 g样品,用灭菌纯水把叶片冲洗干净,吸水纸吸去表面水分。加800 μL CTAB提取液,石英砂适量。冰浴快速研磨1 min,转入2 mL离心管。65温浴20～40 min,间或轻摇离心管。将离心管取出,冷却至室温,加入等体积的氯仿—异戊醇(体积比241)。将离心管上下颠倒几次,充分混匀,10 000 r/min离心15 min。吸取上清液400 μL,加入等体积的氯仿—异戊醇重复抽提1次,离心。取上清液300 μL,加07倍体积的冰冻异丙醇,缓缓平转离心管,可见白色的DNA絮状物,4冰箱放置20 min～2 h。10 000 r/min离心15 min,弃上清液。用体积分数70%乙醇1 000 μL清洗沉淀2次,10 000 r/min离心5 min,倒出乙醇。沉淀室温风干后,加150 μL灭菌纯水溶解,-20 保存，用10 g/L的琼脂糖凝胶电泳检测DNA质量。 　　14PCR扩增及产物测序引物选用DUAN5(5TAGTAACGGCGAGCGAAC3’)、DUAN6(5GGCATAGTTCACCATCTTTC3’)[3] 分别做为上下游引物扩增26S rDNA D1D3区。PCR反应总体积50 μL,含ExPCR buffer 5 μL,三磷酸碱基脱氧核苷酸(dNTPs)375 μL,DUAN5、DUAN6各125 μL,Ex Taq 酶05μ L,模板DNA 15 μL(约50 ng),灭菌水补足50 μL。扩增程序为：94 预变性2 min后进入循环,94 变性30 s,60 复性30 s,72 延伸1 min,循环29次;72 延伸5 min,4 保存。PCR产物经琼脂糖凝胶电泳检测,回收目的片段,送广州英骏生物技术公司用上下游引物进行双向测序。 　　15序列的同源性比对及提交ncbi