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转基因作物pat蛋白双抗体夹心酶联免疫检测方法研究 　　1引言 　　pat基因（Hosphinothricin acethl transferase）由菌株S. viridochromogenes中分离得到，其Bg/11SsⅡ片段编码pat蛋白，通过使乙酰辅酶A与草丁膦游离的氨基结合，形成ACpat复合物，从而使草丁膦失去活性[1]。pat基因编码表达产物pat蛋白分子量约为23 kDa， 为同源二聚体，由183个氨基酸组成[2]，属于乙酰转移酶家族，与乙酰转移酶类具有相对相同的结构和功能[3]。pat蛋白无直接毒性，与已知的毒蛋白无同源性，也不具过敏原的特性，如热或消化稳定性、无糖基化位点等，且在植物中的表达量极低[3]，因此该基因片段也被作为一般转基因作物的标记基因。 　　转基因作物及其产品的检测方法主要有基于核酸水平的检测方法和基于蛋白质水平的免疫学检测方法[4]。核酸检测方法通过检测插入的外源基因，以聚合酶链式反应（PCR）为主[5，6]，包括巢式PCR[7]、多重PCR[8]、竞争性定量PCR[9]、实时定量PCR[10]、和基因芯片[11]等多种检测技术手段。蛋白质水平检测方法主要有酶联免疫吸附法（ELISA）[12，13]和免疫检测试纸条法（Lateralflow）[4]等。免疫检测试纸条操作简便、快速，但ELISA检测方法操作简单、灵敏度高，适合高通量检测，可用于转基因外源蛋白的定量检测。许文涛等[13]利用所纯化的pat蛋白制备得到了抗pat兔多克隆抗体，建立了pat蛋白的检测方法并对转基因和非转基因油菜进行了鉴别，该方法的检出限为20 μg/L。本研究利用所制备的抗pat蛋白鼠单克隆抗体和兔多克隆抗体，建立了pat蛋白的双抗体夹心酶联免疫检测方法，方法灵敏度高，可用于转基因作物中pat蛋白的定性和定量检测。 　　2实验部分 　　2.1仪器与试剂 　　PCR扩增仪（美国BioRad公司）；琼脂糖凝胶电泳仪（北京六一仪器公司）；摇床及电热恒温培养箱（上海智城分析仪器制造有限公司）；Wellwash 4 MK自动洗板机（芬兰Thermo公司）；Centrifuge 5810 R离心机（德国Eppendorf公司）；96孔酶标板（美国Costar公司）。 　　克隆载体pGEMT MD18（Promega公司）、pEASYBlunt（TransGen Biotech公司）； 克隆质粒WLBC9转基因质粒（本实验室保存）；大肠杆菌（E.Coli）菌株DH5α（T公司），原核表达菌株BL21（TIANGEN公司）；Taq DNA聚合酶（TIANGEN公司）； 硅胶模型TMPCR产物纯化试剂盒（赛百盛公司和TIANGEN公司）；T4连接酶、LATaq酶、EcoR1酶、Not1酶、HindⅢ（美国NEB公司）；Ampicillin（Amp）、Kanamycin（Kan）（美国Sigma公司）；PCR扩增引物（北京奥科生物技术有限责任公司）；蛋白纯化试剂盒、原核表达Overnight Express TB培养基（德国Merck公司）。 　　辣根过氧化物酶标记羊抗鼠IgG（IgGHRP）、牛血清蛋白（BSA）、卵清蛋白（OVA）、弗氏完全佐剂、弗氏不完全佐剂、二甲基亚砜（DMSO）和TMB显色液均购自美同Sigma 公司；HRPDAB底物显色试剂盒购于TIANGEN公司，甲醇、乙腈（色谱纯，美国Fisher Scientific 公司）；鼠抗体亚型ELISA鉴定试剂盒（美国Pierce公司），其它化学试剂均为分析纯（北京化学试剂公司）。 　　包被液、洗涤液、样品稀释液、显色液、终止液等免疫检测缓冲液配方参考文献[14]。 　　2.2实验材料 　　转基因抗虫棉和非转基因棉花材料由河间市国欣农村技术服务总会提供。 　　6-7周龄Bal b/c雌性小鼠、新西兰长耳兔（军事医学科学院实验动物中心）；SP 2/0骨髓瘤细胞（中国兽药监察所）。 　　2.3实验方法 　　2.3.1pat基因的克隆、重组质粒构建 　　根据已知序列信息和NCBI网站（http：//）公布序列信息显示，pat基因包括原始序列（Sequence）及经过人工改造后的合成序列（Sequence）。对这两种基因及pat基因进行序列分析，并在实验室保存的转基因质粒WLBC9未知转基因构建质粒全序列的情况下，根据两种序列公布信息，分别利用Primer 5软件设计相应的PCR扩增引物序列，筛选并克隆目标基因片段。回收并连接测序载体pMD18 Simple Tvector，测序鉴定，于NCBI进行Blast比对后，将测序正确的质粒与原核表达载体pET30a（+）同时用限制性内切酶EcoR1和HindⅢ双酶切。用连接酶连接双酶切后的目标基因片段与原核