溶藻细菌H5对汉斯冠盘藻溶藻特性研究.docVIP

溶藻细菌H5对汉斯冠盘藻溶藻特性研究 　　摘要：为了进一步研究溶藻细菌H5的溶藻特性，采用透析、乙醇沉淀、有机溶剂萃取、酸碱稳定性分析等方法探讨了H5溶藻活性物质的特性。结果表明，H5的溶藻活性物质的相对分子质量在3.5～7.0 ku之间，不能用乙醇沉淀法完全分离，具有较好的亲水性，在pH 4～7的酸性范围内溶藻能力较强。H5无菌滤液使汉斯冠盘藻（Stephanodiscus hantzschii）藻细胞丙二醛含量显著上升，SOD活力在处理0～196 h内急剧上升，随后下降，由此推测该活性物质能使藻细胞发生膜脂过氧化，从而破坏了膜的完整性。 　　关键词：溶藻细菌；溶藻活性物质；溶藻特性；汉斯冠盘藻（Stephanodiscus hantzschii） 　　中图分类号：X172 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2013）13-3011-04 　　富营养化已成为众多水体普遍存在的环境问题。随着经济的快速发展，日益增加的工农业污染连同大型水利建设可能使我国的许??河流的富营养化水平进一步升高。自20世纪90年代以来汉江中下游及其支流多次暴发早春硅藻水华[1]；三峡工程建成蓄水后不久，香溪河、大宁河等主要支流库湾每年春季暴发硅藻、甲藻水华[2]。水华发生时水色呈现褐红色、或深或浅的酱油色，并伴有腥味，严重影响了当地景观和生态系统服务功能[3]。面对日益严重的水华问题， 在物理、化学和其他生物方法除藻效果不甚理想的情况下，研究利用溶藻细菌防治水华和赤潮成为一个新的方向，引起了国内外学者的广泛关注。 　　溶藻细菌是水华或赤潮发生时伴随的一类细菌，是一类以直接或间接方式抑制藻类生长或杀死藻类、溶解藻细胞细菌的统称[4]。不少研究者认为水华和赤潮的消亡都可能与溶藻细菌的溶藻功能有关[4，5]。近年来，国内外对溶藻细菌的研究主要集中在溶藻细菌的分离、藻菌的相互作用和胞外分泌物对藻细胞的作用[5，6]，但对于胞外分泌物的性质和溶藻作用机制缺乏深入研究。大多数溶藻细菌的研究都是针对蓝藻水华[5-7]，而对于控制硅藻水华的溶藻细菌的研究则鲜见报道。 　　三峡库区生态环境教育部工程研究中心水污染控制实验室前期从三峡水库香溪河库湾爆发硅藻水华的水体中筛选出1株溶藻细菌H5，并鉴定为纺锤形赖氨酸芽孢杆菌（Lysinibacillus fusiformis），其溶藻方式是间接溶藻，即分泌溶藻物质于胞外，抑制藻类的生长。本试验通过进一步研究溶藻细菌 H5对汉斯冠盘藻（Stephanodiscus hantzschii）的溶藻方式、胞外活性物质的基本化学性质和作用，以期为研制高效的生物化学除藻剂提供基础。 　　1 材料与方法 　　1.1 藻种来源及培养 　　试验所用藻种为汉斯冠盘藻，藻种经活化后，在（15±1）℃、光照度为2 500 lx、光暗周期比12 h∶12 h的培养条件下，采用DM液体培养基[8]， 置于恒温光照生化培养箱中静置培养，间或振荡。藻种的接种及传代过程中均严格按照无菌操作规则进行。采用血球计数板对汉斯冠盘藻细胞浓度进行计数。 　　1.2 细菌培养基 　　细菌培养用LB培养基，分离、纯化和保种采用牛肉膏蛋白胨固体培养基[9]。 　　1.3 溶藻细菌H5无菌滤液的制备 　　取50 mL 溶藻细菌H5种子液加入到 450 mL LB培养基中，于25 ℃、160 r/min振荡培养2 d后，以20 000 g 离心30 min 收集上清液，上清液用0.22 μm细菌滤器过滤，并通过固体牛肉膏蛋白胨平板进行无菌检验，得到H5无菌滤液。 　　1.4 溶藻能力的分析 　　溶藻能力的分析采用Kang等[10]的方法。无菌滤液、细菌培养液等试验组样品按照1∶100的比例接入100 mL指数生长中期的汉斯冠盘藻藻液中，对照组则加入相同体积的新灭菌的LB培养基到指数生长中期的汉斯冠盘藻藻液中，4 d后测定各组汉斯冠盘藻浓度，然后计算杀藻率，杀藻率计算公式为：杀藻率=（1-试验组藻浓度/对照组藻浓度）× 100%。 　　1.5 溶藻活性物质特性分析 　　1.5.1 活性物质相对分子质量大小判定 活性物质相对分子质量大小的分析采用李燕等[11]的方法，略作修改。将500 mL H5无菌滤液经65 ℃旋转蒸发至50 mL，分别取10 mL装入截留相对分子质量为3.5 ku和7.0 ku的透析袋中，将透析袋放入蒸馏水中，以20 ℃、100 r/min振荡透析48 h，透析期间每隔12 h 更换1 次蒸馏水。透析完成后，收集袋内透析样并用无菌水定容至 10 mL，将此透析样经0.22 μm滤膜过滤后按体积比1∶100 接入100 mL 指数生长中期的汉斯冠盘藻藻液中，4 d后测定杀藻率。 　　1.5.2 活性物质乙醇沉淀分