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基于蛋白质原料的体外诊断产品的稳定性问题 Patrick E. Guire backtoheart战友 译 声明：本文仅供丁香园战友内部交流使用，著作权属原文作者。） 免疫诊断产品开发的基础——蛋白质，是一种生物大分子，它根据希腊神话中一位多变的艺术形象——Proteus（希腊海神）而命名。如同他们共通的名字所展示的那样，蛋白质具有改变自身构型的能力，不过这也导致了其活性的丧失。因此，例如抗体、凝集素、酶等蛋白质试剂所具有的特异性结合、催化反应功能，对在预处理、贮存、使用加工等操作过程中存在的潜在有害影响非常敏感。 本文将对关系到体外诊断产品的各种蛋白质稳定性问题进行讨论。一部分问题是关于进行干燥处理的蛋白质的稳定性，另一部分是关于保持在溶液状态的蛋白质的稳定性。 干燥、冷冻或者冻干过程可能会造成蛋白质的严重变性，除非蛋白质得到了适当的保护。因此，正确的干燥方法和保存条件对于干燥组分的保质期至关重要。而溶液状态下蛋白质的稳定性则受到众多可变因素的影响：温度、微生物污染、酸碱度或者缓冲溶液。 此外，本文还将讨论为什么产品性能的问题并不总是应当归罪到稳定性问题上。在生产过程中的因素也许才是罪魁祸首。 蛋白质的特性 蛋白质是一种具有三维空间催化反应或者特异性吸附功能的柔性分子聚合物。催化反应和特异性吸附位点上的氨基酸的空间构相是由这些氨基酸相互之间，以及溶剂、溶质分子的交互作用决定的。 蛋白质分子由亲水和疏水氨基酸组成；这样的一种组成使得蛋白质在水溶液中会自然折叠，让更多的疏水氨基酸折叠聚集在球形蛋白质内部，而让更多的极性氨基酸暴露在能与水结合的表面。 其他起到交联效果的相互作用力包括静电作用、氢键、范德华力、螯合作用以及共价键（比如：二硫键）。其中一些相互作用力对于诸如冷冻、干燥等相变产生的影响非常敏感。 干燥稳定性问题 尽管大多数可特异性吸附的蛋白质在溶液状态的自然构象下发挥作用，但干燥或者冷冻状态仍然是稳定保存的首选。在这些相对稳定的状态下，诸如蛋白酶、氧化剂等有负作用的溶剂与蛋白质的频繁碰撞将会得到最大限度的减少。但是通过干燥或者其他相变方式，比如沉淀和冷冻，将溶剂从蛋白分子中去除，将可能损害蛋白质的功能构造。这些相变可能使通常折叠在分子内部的疏水氨基酸暴露在分子表面，从而造成蛋白质分子通过疏水表面与其他分子结合，导致蛋白质分子的变性。 干燥的方式包括自然风干或者冷冻干燥，例如试剂瓶中结合物的干燥、塑料板或者膜材料上包被抗体的干燥。需要注意避免的是在一系列步骤中无意识间发生的干燥，可能是由于同时操作一大批例如平板或者试管等包被产品而引起，也有可能是由于工作在极其干燥的环境而引起。 在要干燥的溶液中加入适当的溶质来防止蛋白质变性是一种非常有效的保持蛋白质稳定的方法。这些溶质的特点是都具有亲水基团，这些基团通过掩盖疏水性氨基酸从而达到稳定蛋白质功能构造的作用。因此，由于在干燥时溶剂的去除会促进蛋白与蛋白，尤其是蛋白与固相表面的相互作用，所以在干燥前加入稳定剂非常重要。 商品化稳定剂的使用 商品化稳定剂同样适用于保质期的优化。在一个实验中，96孔聚苯乙烯板(Immulon 2; Dynex Technologies Inc.; Chantilly, VA)上包被单克隆或多克隆抗体，这些抗体分别采用以下试剂作为稳定剂：Stabilguard biomolecule stabilizer (SurModics Inc.; Eden Prairie, MN)、 Stabilcoat immunoassay stabilizer (SurModics Inc.)、Superblock blocking buffer (Pierce Chemical Co.; Rockford, IL) 以及牛血清白蛋白 (BSA)。其中使用磷酸盐缓冲液(PBS)作为阴性对照。然后将这些平板干燥并密封保存在放有干燥剂的铝箔袋中。室温保存一段时间后，单克隆抗体包被的平板被用来进行夹心法酶联免疫测定，而多克隆抗体包被的平板则进行以辣根过氧化物酶为抗原的直接吸附测定。 图1. 单克隆抗体在室温下稳定性的研究 在室温下保存18月后，除了以BSA作为稳定剂的单克隆抗体外，所有单克隆抗体样本的活性回收率都在比较好的范围70-80%（见图1）；而多克隆抗体的实验结果则表现出更显著的差异（见图2）。但是，关系到稳定剂Superblock的50%活性的损失，似乎发生在干燥的过程中，而在其后的保存过程中则保持了相对稳定的活性水平。从实验可以看出多克隆抗体比单克隆抗体更加存在活性损失问题，这表明在测试多种产品时可能有必要找到针对每个体系的最适稳定剂。 图2. 多克隆抗体在室温下稳定性的研究 干燥方法的影响 无论是干燥方法还是保存条件，想要保持稳定都