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荔枝ACO1基因克隆及其与幼果落果关系 　　摘 要： 【目的】为了探明荔枝ACC氧化酶（ACO）基因与荔枝幼果脱落的关系，【方法】用RT-PCR和RACE扩增技术相结合的方法进行ACO基因的克隆；在‘黑叶’荔枝花后30 d喷施100 mg·L-1萘乙酸（NAA）来进行荔枝幼果落果的处理；用荧光定量PCR技术分析ACO基因表达与荔枝幼果脱落的关系。【结果】首次从荔枝中分离得到ACO基因，并命名为Lc-ACO1。Lc-ACO1全长为1 231 bp，其中5′非编码区包含89 bp，3′非编码区包含215 bp，开放阅读框包含927 bp，编码309个氨基酸。Lc-ACO1基因含有ACO基因特有的7个保守区和9个不变氨基酸残基。100 mg·L-1萘乙酸（NAA）可以显著促进荔枝幼果的脱落，且处理后相对落果率高峰出现在第10天，而Lc-ACO1基因在离区和幼果中的表达量高峰都出现在第7天，基因表达量高峰比相对落果率高峰早出现3 d。【结论】Lc-ACO1基因可能与荔枝幼果的脱落密切相关。 　　关键词： 荔枝； ACC氧化酶； 基因； 克隆； 表达； 落果 　　中图分类号：S667.1 文献标志码：A 文章编号：1009-9980 　　荔枝（Litchi chinensis Sonn.）属于无患子科（Sapindaceae）荔枝属（Litchi）原产于我国南部，主产区主要分布在广东、广西、福建、海南、台湾等省区。中国大陆各省份中广东省种植面积最大。荔枝的落果非常严重，是限制荔枝产量的主要因子。 　　器官脱落是植物界普遍发生的生理现象，不论是花器中的花瓣、萼片、雄蕊、花冠，还是植物的叶片、成熟或未成熟的果实等都会发生脱落。脱落是一种由各种因素共同调节的复杂生理过程，多种激素对其都有影响，其中乙烯被认为是促进脱落的效应剂，许多实验证明内源乙烯水平与脱落正相关。植物体内乙烯生物合成的途径为：MET（甲硫氨酸）→SAM（腺苷甲硫氨酸）→ACC（l-氨基环丙烷-1-羧酸）→乙烯，其中ACC氧化酶（ACC oxidase，ACO）是乙烯生物合成途径中最后一个酶、也是最关键的一个限速步骤、催化ACC转化成乙烯，控制ACO基因的表达能有效地控制乙烯的生物合成[1]。橄榄中OeACO2基因的表达随着成熟橄榄脱落的发生而不断增强[2]在苹果幼果自然脱落过程中，MdACO1和MdACO2基因在脱落果的果皮中大量表达[3]；Li等[4]对苹果采前落果的研究表明MdACO1??表达模式具有品种差异，在易发生采前落果的‘Golden Delicious’品种的果皮和离区中，MdACO1基因的表达都上调，而在无采前落果的‘Fuji’品种中MdACO1基因表达的增强只发生在果皮中；进一步的研究还发现在乙烯利诱导苹果幼果脱落过程中也表现出MdACO1基因表达的增强[5]。在脐橙中也发现类似的结果，乙烯利处理促进CsACO基因在脐橙叶柄离区和成熟果柄离区中的表达，1-MCP处理则抑制了该基因的表达[6]。但至今未见有关荔枝中ACO基因克隆、表达及其与果实脱落相关的报道，因此本研究通过克隆荔枝ACO基因，并分析其在荔枝幼果落果过程中的表达变化，来揭示ACO基因与荔枝幼果落果之间的关系，为调控荔枝落果提供科学依据。 　　1 材料和方法 　　1.1 材料与处理 　　2009年3月在华南农业大学荔枝园选取长势中庸的10 a生‘黑叶’荔枝2株，其中1株用来整株喷施100 mg·L-1 NAA，另一株用作对照。在花后30 d进行田间处理，处理前先在对照树和处理树上的东南西北方向各挑选15条粗度近似的结果母枝进行挂牌，每5条为一个重复单元，每个处理重复3次。挂牌后记录其果穗上的幼果数并做好标记，每次取样前都要记录其果穗上的果实数。取样时间为处理后0、3、7、10 d。取样后用冰盒迅速带回实验室，将离区和果实分开（在果柄离层部位上下0.2 cm进行离区材料的切取），用液氮速冻后存放于-80 ℃冰箱中备用。 　　荔枝相对落果率的计算公式如下： 　　相对落果率（%）=×100（1） 　　Mt和Mt+d分别代表t时期和t+d时期坐果的数量。 　　1.2 荔枝离层总RNA的提取及其质量检测 　　荔枝离区和幼果总RNA的提取参照吴建阳等[7]进行。提取RNA后立即进行DNA的消化，然后利用紫外分光光度计（UV2501，岛津，日本）测定总RNA样品在260 nm和280 nm处的吸光值，以评价总RNA的纯度并计算其浓度，进一步在甲醛变性琼脂糖凝胶和MOPS缓冲液中电泳检测，以确定总RNA的质量。 　　1.3 引物的设计与合成 　　按照GenBank中登录的已知ACO基因氨基酸保守序列，设计简并引物引物委托上海生工生物工程技术服务有限公司合成。 　　1.4 cDNA