多靶标生物标志物检测微流体磁敏生物传感器研制.docVIP

多靶标生物标志物检测微流体磁敏生物传感器研制 　　摘 要：将磁敏传感器与微流体测试卡集成，研制了可快速检测多靶标生物标志物的微流体免疫磁敏传感器。以3种消化系统肿瘤标志物（甲胎蛋白、癌胚抗原、糖链抗原）为模型靶标，对免疫反应各步反应的液体流速、免疫反应时间以及反应后的冲洗速度进行了优化，评价了多靶标同时检测的系统性能。在微流体磁敏生物传感器系统中，建立了血清样本中3种靶标同时检测的标准工作曲线，AFP、CEA和CA19-9的检出限分别达到0.1 μg/L、0.1 μg/L和30 U/mL，线性范围跨越4个数量级。微流体磁敏生物传感器可在30 min内完成多靶标生物标志物检测，临床血清样本的测试结果与ELISA法一致，具有检测时间短、灵敏度高的优点。 　　关键词：微流体； 磁敏传感器； 多靶标生物标志物 　　1 引 言 　　近年来，微流体技术（Microfluidics technology）快速发展[1，2]，已在化学、医药及生命科学等领域引起广泛关注。微流体芯片，又称为“芯片实验室”（Lab-on-a-chip）[3]，利用微机电技术将一般实验室所使用的分离、反应、混合等装置微小化到芯片上，以进行生化反应、分析，可以对微量流体进行复杂、精确的操作，因其具有体积轻巧、使用样品和试剂量少、反应速度快、平行处理大量样品等优点[4～6]，在生物分析技术领域广泛应用[7～9]。 　　生物传感器技术[10～12]作为生物分析技术中的一个重要分支，结合了生命科学、分析化学、物理学、计算机信息科学等相关技术，能够对待检物质进行快速分析，在医疗检测、环境监测、食品安全、军事安全等领域有广泛的应用。其中， 磁隧道结（Magnetic tunnel junction，MTJ）传感器[10～16]是一种利用巨磁阻效应的新型生物传感器，以超顺磁颗粒为检测探针，具有体积小、成本低、生物背景低、灵敏度高、高通量等特点，有望为生物学[10～14]、药学研究[15]、医学检验[16]等领域提供便携、快捷的新技术平台。 　　肿瘤标志物是指在肿瘤的发生和增殖过程中，由肿瘤细胞本身所产生或由机体对肿瘤细胞反应而产生的，反映肿瘤存在种生长的一类物质。多种肿瘤标志物的联合检测能够提高诊断的准确性，上广泛应用于不同类型肿瘤的早期发现和诊疗[17～20]。目前的肿瘤标志物检测方法主要有酶联免疫分析法（ELISA）、放射免疫分析法、荧光免疫分析法和胶体金试纸条检测等，这些方法多是针对单个标志物的单靶标测试，且耗时长，操作较复杂。结合微流体技术检测体系，可以提高自动化程度；磁敏传感器检测技术，可以进行高灵敏度、高通量、多靶标的快速测试，可以为肿瘤标志物的联合检测提供高效的检测方法。 　　本研究以磁敏传感器为平台，设计并建立研制了一种芯片上的微流体磁敏生物传感器，评价了基于磁敏传感器的消化系统肿瘤标志物多靶标定量检测的可行性。 　　2 实验部分 　　2.1 仪器与试剂 　　磁敏传感器检测仪样机及配套磁敏传感器测试卡（40 mm × 50 mm）由东莞博识生物科技有限公司与中国科学院理化技术研究所联合研制；MTJ传感器阵列（6.6 mm×10.7 mm×0.75 mm，Magic Technologies， US）；DZF-6020型真空干燥箱；L0107-1A注射泵（保定兰格恒流泵有限公司）；BX51荧光显微镜（Olympus公司）；EASY pure LF 超纯水系统（美国Barnstead 公司）。 　　甲胎蛋白（AFP）抗原标准品、癌胚抗原（CEA）标准品、糖链抗原（CA19-9）标准品、抗AFP包被抗体、抗CEA包被抗体、抗CA19-9包被抗体、Biotin标记抗AFP抗体、Biotin标记抗CEA抗体、Biotin标记抗CA19-9抗体（美国Fitzgerald Industries International公司）；牛血清白蛋白（BSA，北京欣经科生物技术公司）；优级纯胎牛血清（北京欣经科生物技术公司）；亲和素-超顺磁颗粒（Avidin-beads，法国Ademtech公司）；3-缩水甘油醚氧基丙基三甲氧基硅烷（GPTS，97%，美国Alfa Aesar公司）；Na2HPO4， KH2PO4， Na2CO3和NaHCO3（美国Merck公司）；实验用水均为超纯水。 　　2.2 磁敏传感器免疫测试原理 　　磁敏传感器是以超顺磁颗粒作为探针，通过MTJ传感器阵列芯片对生物分子捕捉到的超顺磁颗粒的响应，实现对芯片表面的生物分子进行分析检测。在外加磁场作用下，超顺磁颗粒被磁化、产生磁场（图1），磁颗粒产生的磁场干扰下方的MTJ传感器，使其产生电阻率变化、进面转化为电流信号变化，即得到磁颗粒数目的信号[16]。肿瘤标志物的检测是使用夹心免疫反应原理