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基于16S rRNA基因序列分析临床分离乳源菌鉴定和系统进化研究 　　摘要 利用16S rRNA基因序列分析方法对1株临床分离乳源菌进行鉴定并确定菌株的进化位置。抽提细菌DNA基因进行16S rRNA PCR扩增，并对扩增产物测序。成功扩增出长度为1 432 bp的核苷酸序列。该临床分离的乳源菌与GenBank上的已知序列进行了同源性比较，克隆到的序列与Y15856的同源性最低，为99.6%；与AB305019、D83353.1和FM875711.1的同源性最高，达99.9%。该试验菌为金黄色葡萄球菌且16S rRNA基因是高度保守的。利用16S rRNA基因序列分析鉴定细菌是一种快速、准确、方便的方法。 　　关键词 16S rRNA；基因序列；乳源菌；金黄色葡萄球菌；鉴定；系统进化 　　中图分类号 Q812 文献标识码 A 文章编号 1007-5739（2013）11-0291-03 　　DNA序列分析作为微生物鉴定的黄金指标，在众多DNA分析方法中应用广泛[1]。其中，rRNA含量大、种类少，是目前细菌系统分类学研究中最常用的。???于其功能和结构上的保守性，以及良好的时钟性质，可以用于鉴定生物进化的亲缘关系[2]。对于不同菌属、菌种遗传关系的远近，可以通过序列分析进行确定[3]。本研究中，利用从临床奶牛乳房炎分离到的1株细菌，进行16S rRNA基因分析、PCR扩增和测序，再通过测序结果与已知种属的16S rRNA基因序列进行同源性比较确定菌株的种类，最后通过系统进化比较，确定其进化位置。现将试验结果报告如下，以供同类研究参考。 　　1 材料与方法 　　1.1 试验材料 　　1.1.1 供试菌种。试验菌株从四川地区患有乳房炎奶牛的奶汁中分离。 　　1.1.2 供试培养基。Chapman′s 培养基、Mueller-Hinton（MH）琼脂培养基（购于微生物试剂有限公司，批，LB肉汤培养基、普通肉汤培养基（购于北京奥博星生物技术有限责任公司，批。 　　1.1.3 供试试剂。细菌基因组DNA抽提试剂盒（购于上海生工生物技术有限公司）、琼脂糖（购于成都溶海生物有限公司）、Premix-Taq和分子量标准物DL2000（购于Takara公司）、溴化乙锭（EB）（购于Sigma公司）、革兰氏染液。琼脂糖凝胶电泳所用溶液为10 mg/mL溴化乙锭（EB）贮存液、5×TAE电泳缓冲液、1.0%琼脂糖。 　　1.1.4 供试仪器。PCR仪（Eppendorf）、微量移液器??Eppendorf）、超净工作台（AIR TECH，苏净集团安泰有限公司），GL- 21M 高速冷冻离心机（BECKMAN）、DYY - 10C 型电泳仪、DYC- 31D型电泳槽（北京六一仪器厂），凝胶成像系统（美国UVP公司）。 　　1.2 试验方法 　　1.2.1 试验菌培养特性。观察37 ℃普通培养基培养24 h的单个菌落的形态和生长特性，挑取单个菌落于1 mL普通肉汤中培养12 h后用无菌接种环划线接种于Chapman′s培养基37 ℃培养24 h，观察培养基颜色变化。挑取单个菌落进行革兰氏染色。在显微镜下观察其形态。 　　1.2.4 试验菌16S rRNA基因PCR扩增产物电泳检测。取量5 μL耐药金葡菌16S rRNA基因PCR扩增产物以1.0 %琼脂糖凝胶30～45 v/cm电泳检测，观察结果，阳性产物于-20 ℃保存。 　　2 结果与分析 　　2.1 试验菌培养特性培养特性观察结果 　　普通培养基37 ℃培养24 h的菌落呈湿润、光滑、隆起的圆形菌落。在普通肉汤中培养12 h生长迅速，初浑浊，管底有少量沉淀，轻轻振荡，沉淀物上升，旋即消失。Chapman′s培养基37 ℃培养24 h后，培养基由红色变为黄色。 　　2.2 试验菌16S rRNA基因PCR扩增产物 　　2.3 试验菌16S rRNA PCR扩增产物的序列测定 　　试验中，PCR扩增产物经鉴定为阳性，然后将其进行测序（由大连宝生物公司完成）。测序结果表明，送检的DNA片段为1 432 bp，与预期的结果相符。 　　2.4 16S rRNA基因核苷酸序列同源性比较与分析结果 　　2.5 16S rRNA基因的系统进化树分析 　　3 结论与讨论 　　本试验通过对1株从临床奶牛乳房炎分离到的细菌进行了培养特性观察以及对16S rRNA基因片段PCR扩增和测序，与GenBank上的已知序列进行了同源性比较。试验结果表明：试验菌生长特性和镜检结果可以初步判断为葡萄球菌，16S rRNA核苷酸序列与GenBank上的已知序列进行了同源性比较，同源性均99.0%。根据同一种内不同株间基因99%，不同属细菌16S