运用液液萃取-高效液相色谱法对粮食中黄曲霉毒素测定研究.docVIP

运用液液萃取-高效液相色谱法对粮食中黄曲霉毒素测定研究 　　【摘要】 目前使用的黄曲霉毒素测定方法普遍存在着操作复杂、经济成本高等问题,运用液液萃取-高效液相色谱法,以C18反相色谱柱进行分离,并运用柱后碘衍生荧光检测器检测,并经12个样品检测验证,检测方式没有明显的干扰杂质,操作性强,回收率高,准确性高,经济性强。 　　【关键词】 液液萃取-高效液相色谱法;黄曲霉毒素测定;分析研究 　　在自然界中,黄曲霉毒素B1、B2、G1、G2属于较为稳定的真菌毒素,属于黄曲霉菌以及寄生曲霉菌的代谢物,具有较强的毒性,对人体危害性较高[1]。强化对粮食中B1、B2、G1、G2的检测,一直是各国食品安全工作的重要内容,本研究运用优化的液-液萃取精华前处理过程,研制出简便易行的液相检测方式,具有一定的推广与运用价值,本文主要进行简要论述。 　　1 材料和方法 　　1.1 材料 　　仪器设备:美国安捷伦公司出品的高效液相色谱仪配荧光检测器(Agilent 1100)、柱后衍生仪器、氮吹仪、旋涡混合器(XH-B)、离心机、高速均质器、砻谷机、锤式旋风磨,以及色谱柱(Eclipse Plus C18 5um,4.6mmx250mm)。 　　试剂:乙睛(色谱纯)、甲醇(色谱纯),黄曲霉毒素混合标准品,氯化钠(分析纯),二氯甲烷(分析纯)、三氯甲烷(分析纯),超纯水。 　　黄曲霉毒素标准曲线:黄曲霉毒素G1、G2、B1、和B2的混合标准储备溶液(1mL),其中G2、B2以及G1、B1的质量浓度分别为0.3ug/mL和1.0ug/mL。 　　图5 稻谷、小麦、玉米色谱分离干扰分析比较图 　　备注:本图中实线为加样品色谱图,虚线为空白样品色谱图。 　　黄曲霉毒素B1,B2,G1和G2的混合标准工作溶液:将上述混合标准储备溶液以50%比例甲醇进行配比,分别配制出质量浓度为0.15、0.3、1.5、3.0、6.0ug/L的黄曲霉毒素G2,B2混合标准溶液,质量浓度为0.45、0.9、4.5、9.0、18ug/L的黄曲霉毒素G1,B1混合标准溶液。粮食试验品为本地区质监机构提供。 　　1.2 方法 　　样品制备:取稻谷、玉米、小麦各1000g,予以脱壳粉碎并混匀,粒度小于2mm为宜。 　　样品提取:取氯化钠4g、80%比例甲醇溶液以及20g样品,装在搅拌杯中进行快速搅拌2min,并静止相同时间后将提取物经快速滤纸、玻璃纤维滤纸分别过滤后备用。 　　样品净化:将1 mL滤液加入300uL三氯甲烷进行匀振,注入带塞玻璃离心管(事先注入3mL水),并进行离心分层(3min,4000r/min),将上层液体移去,然后加入300uL三氯甲烷进行两次匀振提取,将下层萃取液以氮气吹干,以50%比例的甲醇溶液500uL将其溶解,以0.45um有机相膜实施过滤,滤液备用[2]。 　　色谱条件:色谱柱(Eclipse Plus C185 um,4.6mmx250mmid);流动相:甲醇:乙睛:水(8:1:11),0.8,mL/min流速,20uL进样量,30摄氏度柱温,荧光检测器检测波长为Ex360nm,Em450nm。柱后衍生化系统为0.05%浓度碘溶液、0.3 mL/min流速和70℃反应管温度。 　　定性定量方法以标准物质保留时间对样品峰开展准确定性,取外标法以峰面积进行宗量计算,配比相应浓度溶液实施分析,并绘制标准曲线(质量浓度为横坐标,峰面积为纵坐标)[3]。 　　2 结果 　　2.1 实验条件 　　2.1.1 液-液萃取溶剂及用量确定 　　对比二氯甲烷、三氯甲烷萃取黄曲霉毒素效果进行比较,分别以200uL萃取试液加入1mL水进行外标法加标回收实验,结果如下表1: 　　可见运用三氯甲烷萃取方式加标实验回收率较高,其可以确定为实验试剂。 　　取100-700uL剂量三氯甲烷试剂溶液进行萃取,加标回收实验结果如下图1: 　　可见,从实验精准度以及经济性方面综合考虑,试剂溶液用量应当确定为300uL。 　　2.1.2 液-液萃取加水量优化 　　以上述实验确定的试剂以及剂量进行实验(300uL三氯甲烷萃取),分别从1-9mL开始加水,外标法得加标回收实验结果如下图2: 　　可见选取加水量为3mL较为合适。 　　2.1.3 流动相与流速优化 　　对甲醇+水(4:1)、甲醇+水(9:11)、甲醇+乙睛+水(8:1:11)等几种流动相分析,可知甲醇+乙睛+水(8:1:11)状态下黄曲霉毒素G2、G1、B2和B1色谱峰峰形优于其余流动相,成分分离效果较好,未出现拖尾。在0.5-1.0mL/min区间进行流速变化,可见0.8mL/min状态下峰形较好。在这一状态下,标准品与阳性样品分离色谱图如下图3、4。 　　2.1.4 三种粮