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小立碗藓Ran基因克隆与表达分析 　　同等第一作者：叶 帅（1981-），男，硕士研究生，研究方向为植物分子遗传学；王凤德（1979-），男，副研究员，研究方向为植物分子生物学。 　　摘要：Ran是一种大量分布于细胞核内的小分子的GTP酶，在核质运输过程中具有十分重要的作用，参与调控细胞分裂及其信号传导。本研究利用基于同源序列的PCR技术，从小立碗藓（Physcomitrella patens）中成功克隆了PpRan基因的开放阅读框（ORF）序列，并对其编码的氨基酸序列进行了相关分析。利用半定量PCR技术对PpRan基因在不同组织中以及受到缺磷胁迫时的表达研究发现，PpRan基因的表达具有组织特异性，茎叶体和原丝体中表达量较高，假根中表达量比较低；PpRan基因受缺磷胁迫诱导表达，随着胁迫时间的延长表达量越来越高。这些结果表明，PpRan基因可能在小立碗藓响应缺磷胁迫时发挥重要作用。 　　关键词：小立碗藓；PpRan基因；基因克隆；表达分析 　　中图分类号：Q78 文献标识号：A 文章编号：1001-4942（2013）06-0015-05 　　磷是植物生长所必须的矿质元素，缺磷常导致植物的分枝比正常植株少，茎、根纤细，植株矮小，花果容易脱落等。但土壤中的磷一般不能满足农作物生长发育的需要，必须通过施肥来补充，这无疑增加了作物种植的成本，也存在破坏生态环境的风险。因此，如能克隆与缺磷胁迫耐性相关的基因，并通过基因工程手段改良作物将对农作物经济效益和生态环境都具有重要的作用。 　　GTP结合蛋白（GTP-binding protein）也叫G蛋白，广泛存在于生物界，在细胞信号传导中起着极为重要的作用。低分子量GTP结合蛋白的相对分子量通常在20～30 kD之间，根据分子量大小可以划分为Ras、Rap、Seg、Arf等七种不同的亚类[1]。其中Ran（Ras-related nuclear）也称为TC4[1]，在动物中参与调控细胞周期中各个时期的生命活动，如：调控核运输、启动细胞分裂、DNA复制、RNA的转录和加工（或修饰）、有丝分裂和减数分裂的开始和结束的控制、纺锤体的组装、染色体的正确分配、核膜破裂和重组等。但到目前为止，关于Ran蛋白参与调控植物逆境胁迫反应的研究鲜有报道，尤其是对缺磷胁迫的耐性。 　　苔藓植物是自然界的拓荒者???一，能生活于沙碛、荒漠、冻原地带及裸露的石面或新断裂的岩层上，这种生活的特性可能与其本身的分子调控机制相关。因此，本研究以小立碗藓（Physcomitrella patens）为材料，对其Ran基因进行了克隆和相关表达模式的研究，不仅为了解Ran蛋白的生物学功能奠定了基础，也为植物的抗逆育种提供了理论参考。 　　1 材料与方法 　　11 试验材料 　　小立碗藓由德国Ralf Reski 教授惠赠。 　　12 试验方法 　　121 PpRan基因cDNA编码序列的克隆 利用Trizol 法提取小立碗藓总RNA，采用上海申能博彩生物科技有限公司的反转录试剂盒反转录合成cDNA 第一条链。利用NCBI上公布的小麦、水稻及拟南芥Ran基因的EST序列，通过BLAST比对找出小立碗藓中同源的EST并进行拼接，找出PpRan的ORF，设计特异性引物分别为PpRan-F：5′-ATGGCATTGCCCGGGCAGCAGACTCC-3′和PpRan-R：5′-CTAGCTGTCAAAGGCGTCATCGTCGT-3′。以小立碗藓反转录产物为模板进行PCR 扩增。扩增产物连pGEM-T easy vector System后测序验证。 　　122 序列比对和系统进化树分析 利用DNAMAN 软件，对不同物种（小麦：Triticum aestivum，AAL303961；水稻：Oryza sativa Japanica Group，NP_0010435501；拟南芥：Arabidopsis thaliana，AAN318651；酿酒酵母：Saccharomyces cerevisiae S228C，NP_0148281；果蝇：Drosophila yakuba，XP_0021009021；小家鼠：Mus musculus，NP_033417；人Homo sapiens：NP_0063161）来源的Ran蛋白进行氨基酸多序列比对分析，采用默认参数设置。使用MEGA 40 对不同物种中的Ran蛋白做系统进化分析，采用Bootstrap Test -Neighbor Joining 方法，重复500 次运算。 　　123 PpRan基因在不同组织中的表达模式分析 用Trizol法分别提取小立碗藓茎叶体、假根、原丝体组织的总RNA，反转录。分别以茎叶体、假根、原丝体的反转录产物为模板，利用PpR