酶联免疫吸附法测定玉米中黄曲霉毒素B1含量优势.docVIP

酶联免疫吸附法测定玉米中黄曲霉毒素B1含量优势 　　【摘要】 测定玉米中黄曲霉毒素B1的检测方法,薄层色谱法是较早使用的,试样中黄曲霉毒素B1经提取浓缩、薄层分离后,在波长365 nm紫外光下产生蓝紫色荧光,根据其在薄层上显示荧光的最低检出量来测定含量。 而酶联免疫吸附法是较新、较先进的测定法,试样中的黄曲霉毒素B1经提取、脱脂、浓缩后、与定量特异性抗体反应,多余的游离抗体则与酶标板内的包被抗原结合,加入酶标记物和底物后显色,与标准比较测定含量。本文通过采用两种测定方法测定玉米中黄曲霉毒素B1含量的多次试验,通过全面对比、分析、总结,阐明酶联免疫吸附法测定玉米中黄曲霉毒素B1含量的优势。 　　【关键词】 酶联免疫吸附法薄层色谱法玉米黄曲霉毒素B1 　　黄曲霉毒素是最危险的致癌物,早在1993年黄曲霉毒素已被世界卫生组织(WHO)的癌症研究机构划定为1类致癌物,是一种毒性极强的剧毒物质。黄曲霉毒素的危害性在于对人及动物肝脏组织有破坏作用,严重时可导致肝癌,还可诱发骨癌、肾癌、直肠癌等,甚至死亡。其中以黄曲霉毒素B1最为多见,其毒性和致癌性也最强,其在霉变的粮食及其制品中普遍存在,如玉米,大米、小麦、花生、豆类等。为了预防黄曲霉毒素B1中毒事件的发生,维护人类健康,世界上已有70多个国家和地区对黄曲霉毒素B1含量作了限量要求。我国粮食中黄曲霉毒素B1允许量标准(GB2761-81)规定,玉米、花生仁、花生油中不得超过20μg/kg,玉米及花生仁制品(按原料折算)中不得超过20μg/kg,大米、其他食用油中不得超过10μg/kg,其他粮食、豆类、发酵食品中不得超过5μg/kg,婴儿代乳食品中不得检出,其他食品可参照以上标准执行。 　　下面是本人测定黄曲霉毒素B1的多次实验总结。 　　1 酶联免疫吸附法测定玉米样品中黄曲霉毒素B1 　　1.1 主要仪器与试剂 　　DNM-9602A型酶标分析仪,恒温培养箱,振荡器;黄曲霉毒素B1酶联免疫定量测试盒,甲醇。 　　1.2 仪器工作条件 　　环境温度:21℃;相对湿度:70％;电源条件:220V,50HZ;输入功率:90VA。 　　1.3 实验准备 　　1.3.1 样品预处理 　　称取5.0g已粉碎的玉米样品1、样品2、样品3、样品4、样品5,用称样纸卷筒小心放入100ml具塞三角瓶1???2、3、4、5中,用25.0ml移液管准确加入甲醇水(1+1)溶液,依次加入相当于0.5μg/kg、10μg/kg、20μg/kg、30μg/kg、40μg/kg黄曲霉毒素B1标准使用液,振摇15min,过滤,弃去1/4除滤液,收集式样滤液,此样为样品提取液1、2、3、4、5。0.1ml样液提取液1、2、3、4、5+0.3mlA试剂,D=4,总稀释倍数v/m*D=20,即为待测液1、2、3、4、5。 　　1.3.2 试剂的配制 　　(1)每瓶C试剂(酶标抗原)中准确加入1.5mlD试剂(酶标抗原稀释液),充分溶解,配成试验用酶标抗原液,2～8℃保存。(2)取3mlE试剂(浓缩洗涤液),用57ml蒸馏水,混匀后制成实验用洗涤液。 　　1.4 实验步骤 　　(1)实际平衡:将测试盒与室温中放置15min以上,直至平衡值室温。 (2)小孔编号:取12个小孔放置反应板架上。设定1号孔位仪器调零孔,2-7号孔位AFB1标准对应孔,8-12号孔为样品待测液1、2、3、4、5孔。(3)洗涤:加入250μl左右洗涤液,洗涤液不得溢出,放置1min后,甩掉洗液,在吸水纸上拍干,重复洗版一次。(4)反应组成:按下列步骤所示(见表1),依次加入配制好的溶液剂待测样液。第一步:1号孔加入50μlA试剂(样品稀释液),2-7孔分别加入系列的B试剂(AFB1标准溶液:0,0.1,0.25,0.5,1,2ng/ml)50μl,8-12孔加入待测液1,2,3,4,5。第二步:1号孔加入50μlD试剂(酶标抗原稀释液),其余孔均加入50μlC试剂(酶标抗原稀释液)。第三步:轻轻地振摇,使各孔中的反应物混匀。(5)反应:将反应板放入37℃恒温培养箱中孵育30min。(6)洗涤:取出反应板,用力甩掉反应液,拍杆。每孔加入250μl左右洗涤液,洗涤液不得溢出,在吸水纸上拍干,重复洗涤4次。(7)显色:每孔分别加入F试剂(显色底物液a)和G试剂(显色底液b)各50μl,摇匀,将反应板放入37℃恒温培养箱中显色15min。(8)终止与仪器测定:每孔分别加入H试剂(终止液)50μl,摇匀后用酶标测定仪在450nm波长处测定各孔的吸光度A值。 　　2 采用薄层色谱法测定样品 　　采用薄层色谱法测定样品1、样品2、样品3、样品4、样品5中黄曲霉毒素B1,经提取浓缩、薄层分离后,在波长365nm紫外光下产生蓝紫色荧光,