第二章PCR技术PPT课件.ppt

GTCC GGAC CCTG CAGG GTCC GGAC CCTG CAGG CCTG GGAC GTCC CAGG 质粒DNA 目的基因 限制性核酸内切酶 2.基因检测 A’ 内源性病变基因 正常人 A 病 人 病原微生物基因 正常人 (-) 病 人 (+) 特异性 － 热启动 Taq酶 原 理 蜡封 抗体抑制 化学修饰 特 点 避免非特异性扩增 提高PCR反应的 特异性 用 途 基因组扩增 RT-PCR － 热启动 Taq酶 特异性 保真性 — 高保真酶 原 理 用 途 3’－5’核酸 表达基因的克隆 基因的定点突变 细胞内基因点突变分析（SNP） 外切酶活性 降低碱基错配率 保真性 — 高保真酶 高保真 ＋ 高扩增效率 原 理 混合酶 －高扩增效率 － 3’－5’核酸外切 用 途 超长片段扩增 －测序 －构建基因图谱 复杂模板扩增 －GC含量高 －二级结构 高保真 ＋ 高扩增效率 PCR MasterMix 原 理 预配好的PCR反应液 DNA聚合酶 反应缓冲液 dNTP PCR增强剂 PCR Master Mix 特 点 快速简便 减少加样误差和污染 灵敏度高 可扩增低至2个拷贝的目的模板 特异性强 降低PCR反应的要求，增强特异性 稳定性好 长期放置活性无改变 适用范围 大规模基因检测 目的基因拷贝数极低的样本 GC含量高,有二级结构的模板 复杂基因组样本 可直接检测菌落，基因点突变检测, 或者阳性克隆的筛选。 1）PCR反应成分 （1）模板 单、双链DNA均可。 不能混有蛋白酶、核酸酶、DNA聚合酶抑制剂、DNA结合蛋白类。 一般100ng DNA模板/100?L。 模板浓度过高会导致反应的非特异性增加。 6.PCR反应条件 （2）引物浓度 0.1-0.5 ?mol/L 浓度过高易导致模板与引物错配,反应特异性下降。 （3）Taq DNA聚合酶（thermus aquaticus) 0.5-2.5 U/50 ?l 酶量增加使反应特异性下降;酶量过少影响反应产量。 （4）dNTP dNTP浓度取决于扩增片段的长度 四种dNTP浓度应相等 浓度过高易产生错误碱基的掺入，浓度过低则降低反应产量 dNTP可与Mg2+结合，使游离的Mg2+浓度下降，影响DNA聚合酶的活性。 （5） Mg2+ Mg2+是DNA聚合酶的激活剂。 0.5mmol/L-2.5mmol/L反应体系。 Mg2+浓度过低会使Taq酶活性丧失、PCR产量下降； Mg2+过高影响反应特异性。 Mg2+可与负离子结合，所以反应体系中dNTP、EDTA等的浓度影响反应中游离的Mg2+浓度。 2）循环参数 变性 使双链DNA解链为单链 95oC 20-30秒 (2) 退火 温度由引物长度和GC含量决定。 增加温度能减少引物与模板的非特异性结合;降低温度可增加反应的灵敏性。 （3）延伸 70-75oC， 延伸时间由扩增片段长度决定 （4）循环次数 主要取决于模版DNA的浓度 一般为25-35次 次数过多：扩增效率降低 错误掺入率增加 第二节 PCR的类型和应用 研究 基因克隆，DNA测序，分析突变 诊断 细菌、病毒、寄生虫检测，诊断 人类基因组工程 遗传图谱的构建，DNA测序，表达图谱 法医 犯罪现场标本分析 肿瘤 各种肿瘤检测 其他…… 1.不对称PCR 目的：扩增产生特异长度的单链DNA。 方法：采用两种不同浓度的引物。分别称为限制性引物和非限制性引物,其最佳比例一般是0.01∶0.5μM,关键是限制性引物的绝对量。 用途：制备核酸序列测定的模板 制备杂交探针 基因组DNA结构功能的研究 一、类型 高浓度引物 低浓度引物 2. 反向PCR (reverse PCR) 是用反向的互补引物来扩增两引物以外的DNA片段对某个已知DNA片段两侧的未知序列进行扩增。 可对未知序列扩增后进行分析,如探索邻接已知DNA片段的序列；用于仅知部分序列的全长cDNA的克隆,扩增基因文库的插入DNA；建立基因组步移文库。 已知序列 未知序列 未知序列 已知序列 未知序列 未知序列 限制酶 限制酶 连接酶 3. 多重PC