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病毒学方法技术研究进展 　　摘 要 从早期的结晶提纯到今天的分子细胞水平的病毒学研究，病毒学的研究随着时间而不断发展，而病毒学发展的重要依据就是相关技术方法的不断进步。本文从病毒的鉴定检测方法、病毒的分离与培养方法、病毒的功能机制研究方法这三个方面总结现在病毒学研究的常用方法，为通用的技术方法提供参考依据，以推动病毒研究的技术改革与创新，为今后的研究工作奠定良好的基础。 　　关键词 病毒学 方法 分子细胞水平 　　中图分类号：G644 文献标识码：A 　　相对动物学或者植物学这些传统学科，病毒学是一门始创于20世纪40年代的新兴学科。虽然在此之前，就有发现能通过细菌过滤器的烟草花叶病致病因子的科学家D.Ivanofsky，以及发现具有滤过性的口蹄疫病原的科学家Loeffler和Frosch，但是基于历史条件和知识水平的限制，人们或许观察到了病毒引起的自然现象，却无法对其产出真正科学的认识。 　　病毒学的里程碑事件应属1935年美国科学家Stanley对于烟草花叶病毒的提纯，使人们不再空泛地想象病毒的存在，而是真切地观察和接触到病毒，为今后的研究开辟了广阔的道路。随后，观察手段，培养方法，以及相关的病理性研究手段的不断提升，也使得病毒学这样一门起步较晚的学科开始了飞速发展。 　　回顾病毒学研究的发展历程，不难发现，学科的发展很大程度上依赖于技术的进步与革新，以及与相关学科的借鉴与学习。故了解和掌握病毒学方法技术的发展历史以及技术要求，对于学科的研究，以及技术的创新，都有诸多裨益。 　　1 病毒鉴定检测的相关方法技术 　　对于病毒最直观的认识无疑是其生物学上特征，如病毒的理化性质（如病毒粒子的形态、大小、对理化因子的耐受性、特外存活期等）以及在寄主上的反应（如寄主范围、症状表现、传播方式等）。目前，病毒生物学特征的研究鉴定方法主要分为三大类：显微成像技术（或相关针对病毒形态结构观察的技术）、免疫-血清学检测和分子生物学检测。 　　1.1 病毒形态结构的观察技术 　　众所周知，病毒颗粒的大小远小于普通细菌，所以对病毒最直观的鉴定方法就是使用电镜观察，它可以??接地看到病毒的形态结构、存在与否。自第一台电子显微镜的诞生，这门技术已为病毒学在内的多种生物学科作出了重要的贡献，优点也十分明显，操作简便，快捷有效，所以，即使是在进入了分子研究水平的今天，电子显微镜仍然发挥着它不可替代的作用。 　　另外，在原始的技术基础之上加以改进也形成了一些针对特殊观察对象的电镜技术，如电镜负染技术和免疫电镜检测技术等。低温电镜技术，就是一种结合电镜技术和低温结晶观察病毒的三维结构的技术，其优点不仅在于其分辨率更高，而且对于病毒样品的损伤和失真的概率都大大减小，常用于极微量和高保真要求的病毒观察检测。 　　X-射线衍射技术是通过扫射病毒微晶得到的衍射图像来分析还原原始的病毒结构，但为了保证衍射图像的准确性，往往对样品的纯度和颗粒完整性要求较高，所以这种技术的使用范围相对受限。 　　核磁共振技术，相对于前面提到的技术，对于操作的要求更低，运用范围也更广，但是对于结构的准确性判断略低。此技术主要用于病毒短肽的分析以及蛋白小分子构象变化的研究。 　　1.2 免疫-血清检测方法 　　此类技术的原理主要根据病毒的侵染性以及其作为核蛋白的特性而设计的。运用最为广泛的还是血清学测试，即利用血清中可以和具有某种特定结构特征的病毒结合的抗体，从而进行病毒的定性定量分析。此法也广泛应用用于医学临床的诊断，操作简便，低廉有效。 　　酶联免疫吸附实验（ELISA）也是利用特异抗体吸附病毒颗粒的原理，只是在抗体上附带了酶标记，从而使反应可以有颜色强弱的变化，利于定时定量监测病毒浓度。此法灵敏度高，且不受浓度范围或其他抑制剂的干扰，也越来越多地应用于相关的生产实践中。 　　免疫组化技术也是将抗体带上特殊的显色基团，使其游离时不显色，而于抗原物质结合后显色。利用这个特点，可以检测特定组织中不同区域的病毒含量已经分布特点，利于进行组织性毒理分析。 　　1.3 分子生物学检测方法 　　病毒寄生在宿主细胞内，但它又有不同于宿主细胞的特异基因组序列，特异序列的存在就说明病毒的存在，这就是分子生物学检测病毒的原理。 　　聚合酶链式反应（PCR）是其中最为常用的一种检测手段，其原理即利用DNA半保留复制的特点，以原始DNA为模板合成两条一样的双链，从而达到扩增量指数增长，DNA总量可检测的目的。另外，由于病毒的核酸有的是DNA，有的是RNA，所以常规的PCR以及反转录PCR即可针对不同的病毒基因进行检测。 　　实时定量PCR与传统PCR基本相同，只是在体系中加入荧光基团，反应中利用CCD实时读取荧光信号，检测。不仅减少的污染和浪费，也使定量快速而方便，可