苏云金芽孢杆菌Cry2Aa蛋白体外表达及纯化.docVIP

苏云金芽孢杆菌Cry2Aa蛋白体外表达及纯化 　　摘要：根据大肠杆菌密码子偏好性对苏云金芽孢杆菌（Bacillus thuringiensis）cry2Aa基因进行优化，并合成全长基因，将cry2Aa基因克隆到表达载体pET-44a上，转化到大肠杆菌Rosetta中进行诱导表达，优化表达条件，采用亲和层析和SDS胶回收纯化，Western blot鉴定回收产物。结果表明，IPTG浓度为0.50 mmol/L、27 ℃诱导4 h时Cry2Aa蛋白表达量最高，SDS胶回收Cry2Aa纯化蛋白所得的产量高于亲和层析法。 　　关键词：苏云金芽孢杆菌（Bacillus thuringiensis）；Cry2Aa蛋白；表达；纯化 　　中图分类号：S476+11 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2013）03-0702-04 　　苏云金芽孢杆菌（Bacillus thuringiensis，Bt）是一种能够产生多种杀虫晶体蛋白（Cry）的土壤细菌[1，2]，Bt的cry基因已成功转入很多主要农作物（Bt农作物），包括玉米、棉花、西红柿等，使它们具有抗虫特性[3-6]。Cry1类杀虫晶体蛋白对鳞翅目害虫具有特异毒性，在微生物和植物基因工程中得到了广泛的应用，但其存在着杀虫谱狭窄、昆虫产生抗药性等问题[7，8]。Cry2类蛋白在结构和杀虫机制上不同于Cry1类，如Cry2Aa既对鳞翅目害虫有毒性又能杀害双翅目害虫[9]。研究显示转cry2Aa基因的鹰嘴豆对豆荚蛀虫有较强的毒性[10]，而转cry2Aa基因的水稻对其传粉昆虫如中华通草蛉无危害性[11]。本研究合成密码子优化的cry2Aa基因，体外重组表达Cry2Aa蛋白并进行优化，以期为进一步求证Cry2Aa的安全性奠定基础。 　　1 材料与方法 　　1.1 材料 　　苏云金芽孢杆菌Cry2Aa蛋白序列由华中农业大学林拥军教授提供，与NCBI（http：//）中相关序列（M31738）仅有少数氨基酸不同。pET-44a质粒、大肠杆菌TOP10和Rosetta菌株由广州市过敏反应与临床免疫重点实验室保存；Strep Trap HP预装柱和低分子量蛋白Marker购自GE公司；StrepⅡ标签抗体购于Merck公司。cry2Aa基因的上下游引物分别为5′CATATGAACAACGTCCTGAACTCCGGT 3′（划线部分为NdeⅠ酶切位点），5′CTGCAGGTACAGCGGCGGTAAATTAGT 3′（划线部分为PstⅠ酶切位点），由上海博尚生物技术有限公司合成。 　　1.2 密码子优化 　　根据大肠杆菌同义密码子的偏好性，采用在线软件Condon Usage Database（http：//www. kazusa.or.jp/codon/）对cry2Aa基因进行密码子优化，之后手工校正。 　　1.3 重组蛋白的诱导表达及亲和纯化 　　密码子优化后的cry2Aa基因序列送交上海博尚生物技术有限公司进行全基因合成，合成基因连接pUC57，转化到大肠杆菌TOP10菌株中保存。抽提pUC57-Cry2Aa，用NdeⅠ和PstⅠ双酶切后亚克隆到表达载体pET-44a，构建pET-44a-Cry2Aa，转化表达宿主菌Rosetta进行IPTG诱导表达，优化表达条件以获得最佳诱导表达参数。表达菌扩大培养，超声波破碎，收集破碎上清和沉淀，沉淀用含6 mol/L尿素的缓冲液裂解，利用AKTA-FPLC系统，通过亲和层析纯化出带有StrepⅡ标签的蛋白，具体操作遵照Strep Trap HP预装柱的使用说明书进行。 　　1.4 SDS胶回收 　　将Cry2Aa蛋白进行常规SDS；电泳后采用KCl染色，用切胶刀准确切下目的蛋白条带，将胶片装入透析袋中，使用水平电泳仪进行电泳，使膜上的蛋白质回到洗脱液中。电泳结束后用ddH2O进行透析。最后收集透析袋中的液体，冻干。 　　1.5 Western blot分析 　　纯化蛋白或诱导菌裂解液经SDS电泳后将凝胶上的蛋白质电转移至PVDF膜上，用含50 g/L脱脂奶粉的PBST缓冲液室温封闭2 h后，加入已偶联HRP的StrepⅡ标签抗体（1∶4 000稀释），4 ℃孵育过夜；用PBST和PBS室温下在脱色摇床??进行洗涤；最后用二氨基联苯胺（DAB）底物液显色，检测目的蛋白特异性及分子量大小。 　　2 结果与分析 　　2.1 cry2Aa基因的合成及重组表达载体pET-44a-Cry2Aa的构建 　　经密码子优化后人工合成cry2Aa基因，应用大肠杆菌克隆扩增质粒pUC57-Cry2Aa，双酶切获得1 908 bp的cry2Aa基因序列（图1），进一步将cry2Aa基因亚克隆到表达载体pET-44a中，转化表达宿主菌Ro