高中生物选修一生物技术实践专题5NA和蛋白质技术.pptVIP

　　一、DNA的粗提取与鉴定 　　1.实验材料的选择： 选用DNA含量相对较高的生物组织，如鸡血、菜花、洋葱等。 　　2.提取原理：DNA与杂质的溶解度不同，DNA与杂质对酶、高温、洗涤剂的耐受性不同。 　　3.步骤： 　　（1）破碎细胞：动物细胞（以鸡血为例），加入蒸馏水，同时用玻璃棒搅拌，过滤后收集滤液。植物细胞（以洋葱为例），加入洗涤剂和食盐 ，充分研磨和搅拌，过滤后收集研磨液。 　　（2）去除杂质：利用DNA在不同浓度的NaCl溶液中 溶解度 不同，去除杂质。 　　（3）DNA析出：在处理后的滤液中加入 等体积、冷却的酒精 溶液，析出DNA。 　　（4）DNA的鉴定：加入 二苯胺 试剂，沸水浴，出现浅蓝色。 　　二、PCR技术：全称是 多聚酶链式反应。 　　1.PCR原理：利用了DNA的热变性原理，通过控制温度来控制双链的解聚与结合。 　　2.PCR反应的条件：①缓冲液；② DNA模板； ③ 两种引物； ④四种脱氧核苷酸；⑤Taq DNA聚合酶。 　　3.PCR的反应过程 （1）变性：温度上升到90℃以上，双链DNA在热作用下，氢键断裂，形成两条单链DNA。 （2）复性：温度下降到50℃左右，两种引物通过碱基互补配对原则与两条单链DNA结合。  　　（3）延伸：温度上升到 72℃ 左右，在 TaqDNA聚合 酶的作用下，以 四种脱氧核糖核苷酸 为原料，根据碱基互补配对原则，合成DNA新链。 　　4.PCR扩增的方向：合成DNA方向是从子链的5′端向3′端延伸。 5. DNA含量的测定 （1）原理：DNA在260nm的紫外线波段有一强烈的吸收峰，峰值的大小与DNA含量有关。 （2）过程：稀释→对照调零→测定→计算。 　 　　三、血红蛋白的提取和分离 　　1.凝胶色谱法和电泳的原理 　　(1)凝胶色谱法：不同相对分子质量的蛋白质通过凝胶时，相对分子质量较小的蛋白质容易进入凝胶内部的通道，路程较长，移动速度较慢；相对分子量较大的蛋白质无法进入凝胶内部的通道，只能在凝胶外移动，路程较短，移动速度较快。　 　　(2)电泳：利用待分离样品中各种分子带电性质的差异 以及分子本身的 大小 、形状 不同使带电分子产生不同的 迁移速度 。 　　2.凝胶色谱法分离蛋白质的实验操作步骤 　 （1）样品处理：红细胞的 洗涤 　血红蛋白的释放分离血红蛋白溶液 　 透析 。 　 （2） 凝胶色谱操作： 凝胶色谱柱的制作 　凝胶色谱柱的装填样品的加入和洗脱 　 SDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳 。 DNA的粗提取与鉴定　 　　1.基本原理：　 　（1）DNA在NaCl溶液中的溶解度随氯化钠溶液浓度的变化而改变，DNA在0.14 mol／L的NaCl溶液中溶解度最低。 　（2）DNA不溶于酒精溶液，但细胞中的某些物质则可以溶于酒精。　 　（3）DNA不被蛋白酶所水解。 2.方法目的： 　　3.两次加入蒸馏水的目的  　　第一次目的是使成熟的鸡血细胞涨破释放出DNA；第二次目的是稀释NaCl溶液，使DNA从溶液中析出。 　　预冷的酒精溶液具有以下几个优点： 　　a.抑制核酸水解酶活性，防止DNA降解； b.降低分子运动，易于形成沉淀析出； c.低温有利于增加DNA分子的柔韧性，减少断裂。 PCR技术 　　1.PCR原理：利用了DNA的热变性原理，通过控制温度来控制双链的解旋与结合。 　　2.DNA的合成方向　 　　DNA的两条链是反向平行的，通常将DNA的羟基末端称为3′端，而磷酸基团的末端称为5′端。DNA聚合酶不能从头开始合成DNA，而只能从3′端延伸DNA链，因此，DNA复制需要引物。 　　当引物与DNA母链通过碱基互补配对结合后，DNA聚合酶就能从引物的3′端开始延伸DNA链，DNA的合成方向总是从子链的5′端向3′端延伸。 　　3.PCR的反应过程 　　PCR一般要经历三十多次循环，每次循环可以分为变性、复性和延伸三步。 　　从第二轮循环开始，上一次循环的产物也作为模板参与反应，并且由引物Ⅰ延伸而成的DNA单链会与引物Ⅱ结合，进行DNA的延伸，这样，DNA聚合酶只能特异地复制处于两个引物之间的DNA序列，使这段固定长度的序列呈指数扩增。 4.细胞内DNA复制和PCR比较 　　5.PCR技术优点及应用 　　 PCR是一种体外迅速扩增DNA片段的技术，它能以极少量的DNA为模板，在几小时内复制出上百万份的DNA拷贝。这项技术有效地解决了因为样品中DNA含量太低而难以对样品进行分析研究的问题，被广泛地应用于遗传疾病的诊断、刑侦破案、古生物学、基因克隆和DNA序列测定等各方面。 　　6.扩增DNA含量的