第四章 核酸操作的基本原理.pptVIP

第一节 核酸的提取与纯化 制取核酸样品的根本要求是保持核酸的完整性 一、DNA提取的基本原理与方法 （一）DNA提取的基本原理 DNA是极性化合物，溶于水不溶于乙醇、 氯仿等有机溶剂 DNA多以脱氧核蛋白（DNP)形式存在 提取DNA时用先将DNP抽提出来，在将DNA 分离出来 （二）基本步骤 破碎细胞并对DNA快速实施保护 （二）、DNA提取的几种方法 浓盐法 SDS法 CTAB法 苯酚抽提法 水抽提法 1.浓盐法 2.SDS （十二烷基硫酸钠）法 3.CTAB（十二烷基三乙基溴化铵）法 4.苯酚抽提法 蛋白分子溶于酚相，而DNA溶于水相。 离心分层后取出水层，多次重复操作， 合并含DNA 的水相，用乙醇沉淀DNA 。 此法的特点是使提取的DNA保持天然状态  5.水抽提法 利用核酸溶解于水的性质, 用低盐溶液除去RNA 此法提取的DNA中蛋白质含量较高,故一般不用. （三）核外 DNA 的提取 核外DNA包括： 质粒DNA 线粒体DNA 叶绿体DNA 二、 RNA提取的基本原理与方法 （一） 总RNA提取的基本原理与方法 1.总RNA提取的基本原理 RNA分离的关键因素是尽量减少RNA 酶 ( RNase) 的污染 造成RNase酶污的主要来源有 : 所用的器皿、所用的溶液、实验人员的手及飞沫 玻璃器皿：烘箱中(180℃) 烘烤 8h 以上 , 塑料器皿：0.1%DEPC(diethylpyrocarbonate, 二乙基焦碳酸盐)浸泡或用氯仿洗涤 ; 配置的溶液应尽可能用 0.1% DEPC在37℃处理12h以上,然后高压灭菌 ; 全部实验过程均需戴手套操作,并经常更换 ; RNA 电泳槽常用去污剂洗涤,0.1%DEPC处理 2.总RNA提取的方法 异硫氰酸胍 -氯化铯超速离心法 盐酸胍-有机溶剂法 氯化锂 -尿素法 （二） mRNA 的提取 一般有两条途径： 其一是先提取细胞总 RNA, 然后再从中分离带 poly(A) 的 mRNA; 其二是先提取多聚核糖体 , 再将蛋白质与 mRNA 分开。 三、核酸的检测 紫外分光光度法 琼脂糖凝胶电泳法 1.紫外光度法原理： DNA或RNA分子在260 nm处有特异吸收峰，吸收强度与系统中DNA或RNA的浓度成正比。 方法： 首先用TE或ddH2O稀释待测DNA样品 用TE或ddH2O为空白对照，在260 nm及280 nm处调节紫外分光光度计读数为0 加入DNA稀释液与上述两波长处读取OD值。 浓度计算（单位：μg/ml) 双链DNA（ds DNA） =50×OD260×稀释倍数 RNA(ssRNA)浓度 =40× OD260×稀释倍数 单连DNAssDNA =33× OD260×稀释倍数 纯度检测 可通过OD260/ OD280来衡量 OD260/ OD280为1.8左右为好 ＞1.8为RNA污染， ＜1.8为蛋白质污染 2. 琼脂糖凝胶电泳法 核酸分子是多聚阴离子, 在电场中向正电极的方向迁移 在一定的电场强度下，DNA分子的电泳迁移率，取决于核酸分子本身的大小和构型。 原理： DNA与溴化乙锭（EB）形成的络合物 在紫外光照射下能发射荧光，荧光的强度与DNA的含量成正比。 因此可十分敏感而方便地检测出凝胶介质中 DNA 。 根据谱带的形状可反应DNA的质量 同时 , 通过同已知分子质量的标准 DNA 片段之间的比较 , 还可测定出随迁移的 DNA 片段的分子质量。 四 核酸的保存 (一)、 影响核酸保存的关键因素 关键的因素是保存液的酸碱度和保存温度。 1. 保存液的酸碱度 水、过酸过碱可以断裂核酸的氢键 2. 保存温度 温度升高会降低核酸的稳定性, 所以 核酸一般都是低温保存。 (二 )、核酸制品的保存方法 保存条件 溶液： TE (tris-Hcl EDTA pH8.0) ddH2O 温度： -70 ℃ 一年以上 -20 ℃ 半年左右 4 ℃ 数月内 第二节 凝胶电泳技术 核酸分子是多聚阴离子，在电场中向正极的方向迁移 在一定的电场强度下，DNA分子的迁移率取决于核酸分子本身的大小和构型 2.琼脂糖电泳的影响因素 1、 DNA的分子大小: