不同条件对产黄青霉菌原生质体制备率与再生率影响.docVIP

不同条件对产黄青霉菌原生质体制备率与再生率影响 　　摘 要：本文研究了不同菌龄、预处理时间、酶解时间、酶浓度等对产黄青霉菌原生质体制备率与再生率的影响，确定了有利制备率与再生率提高的最佳条件。 　　关键词：产黄青霉菌 原生质体制备 原生质体再生 　　中图分类号：R965 文献标识码：A 文章编号：1672-3791（2013）04（a）-0123-01 　　原生质体融合能将遗传特性不同的两亲本原生质体融合杂交，筛选后获得集双亲优良性状于一体的稳定融合子[1]。当前使用最广泛的就是以PEG为融合剂的化学法，具有经济、方便、可重复性强等优点[2]。产黄青霉菌是原生质体融合的常用菌种，原生质体制备是融合的前提。本文探讨了在菌龄、预处理时间、酶解时间、酶浓度等不同水平下，同时有利于制备率与再生率提高的综合条件，为提高产黄青霉菌与其他菌的融合提供了实验依据。 　　1 材料和方法 　　1.1 材料 　　1.1.1 菌种 产黄青霉菌 　　1.1.2 试剂 　　（1）缓冲液（CPB）：0.2 mol/L、pH6.0的柠檬酸缓冲溶液中。按文献[4]配制。 　　（2）高渗缓冲液：以CPB配制的0.8 mol /L山梨醇。 　　（3）酶液：以CPB配制。（4）预处理剂：0.05 mol/L EDTA-Na2溶液+0.2%β-巯基乙醇，以CPB配制。 　　1.1.3 培养基 　　（1）液体完全培养基（YEPD）：参照文献[3]。（2）再生培养基（YEPDS）：参照文献[3]。 　　以上均以0.73×105Pa灭菌30min。 　　1.2 方法 　　1.2.1 原生质体制备 　　参照文献[4]。 　　1.2.2 原生质体再生 　　参照文献[4]。 　　1.2.3 影响原生质体制备率与再生率的单因素试验 　　（1）菌龄：14 h，16 h，18 h，20 h。（2）预处理时间：10 min，20 min，30 min。 　　（3）酶解时间：15 min，30 min，45 min，60 min，90 min，120 min。（4）酶浓度：0.5%，1.0%，2.0%，4.0%。 　　2 结果与分析 　　2.1 不同处理条件对产黄青霉菌原生质体制备率与再生率的影响 　　2.1.1 菌龄对制备率与再生率的影响 本试验研究了同时接种后培养12 h、14 h、16、18 h菌龄的菌体相对应的制备率依次为94.8%、91.1%、83.4%、71.7%，再生率依次为2.5%、3.0%、3.3%、3.9%。试验结果可见，再生率随着菌龄延长，产黄青霉原生质体的制备率逐渐降低，而再生率则逐渐升高。 　　2.1.2 预处理时间对制备率与再生率的影响 　　预处理时间10 min、20 min、30 min对应的制备率依次为80.3%、88.1%、91.9%，再生率依次为4.2%、3.6%、1.9%。试验结果可见，预处理对原生质体的制备有促进作用，制备率随预处理时间延长而升高；但是对细胞壁的再生起副作用，再生率随时间延长而下降。 　　2.1.3 酶解时间对制备率与再生率的影响 　　酶解时间15 min、30 min、45 min、60 min、90 min、120 min对应的制备率依次为55.1%、85.1%、89.3%、91.0%、93.2%、95.2%，再生率依次为4.2%、3.3%、2.3%、1.1%、0.9%、0.6%，试验结果可见在120 min内，原生质体形成率与酶作用时间成正比递增，120 min左右细胞基本原生质体化，但是再生率在15 min时最高，随时间延长而降低。 　　2.1.4 酶浓度对制备率与再生率的影响 　　对0.5%、1.0%、2.0%、4.0%的酶浓度对制备率与再生率进行试验，对应的制备率依次为63.25%、73.58%、88.57%、90.68%，再生率为4.15%、3.55%、3.23%、1.60%。结果可见，随着酶浓度的增加原生质体的制备率升高，再生率降低。 　　2.2 优化条件下的产黄青霉原生质体制备率与再生率 　　综合以上试验结果可以得出如下结论：菌龄16 h，以2.0%蜗牛酶进行酶解，酶解温度30℃，酶解时间30 min，0.8 mol/L山梨醇做渗透压稳定剂，以0.05 mol/L EDTA-Na2溶液和0.2%β-巯基乙醇为预处理剂处理20min为产黄青霉原生质体制备率和再生率均较高的最佳条件。在此优化条件下，原生质体形成率为85.1%，再生率为3.8%。 　　3 讨论 　　3.1 制备率 　　菌体的原生质体制备主要是细胞的去壁，菌龄与细胞壁密切相关。对数生长期的菌体细胞壁较薄，对酶更加敏感；稳定期细胞壁厚，不利于酶解，制备率反而会随菌龄的延长而降低。