半夏软腐病内生拮抗真菌筛选及鉴定.docVIP

半夏软腐病内生拮抗真菌筛选及鉴定 　　摘 要：从浙江、山东、四川、江西采集的135株半夏样品中分离出76株内生拮抗菌，经过平板对峙培养法进行初筛和半夏离体块茎复筛，筛选出2株拮抗真菌SC6和SC7，这2个菌株能完全抑制软腐病的发生。通过形态学和ITS rDNA序列分析，鉴定菌株SC6和SC7均为曲霉属土曲霉（Aspergillus terreus）。 　　关键词：半夏；内生真菌；拮抗；鉴定 　　中图分类号：S435.672 文献标识号：A 文章编号：1001-4942（2013）11-0103-04 　　半夏[Pinellia ternata（Thunb.）Breit.]为天南星科多年生草本半夏属植物，其块茎可入药，是一种重要的药用植物[1，2]。现代药理研究证明半夏的主要功效有镇咳祛痰、降逆止呕、消痞散结、抗心律失常、降血脂、抗肿瘤、抗早孕、镇静催眠、解毒抗炎、降血压等，临床应用十分广泛[3，4]。 　　自20世纪70年代开始人工栽培半夏以来，半夏栽培面积逐渐扩大。随着种植规模的扩大，病害成了限制半夏种植的技术瓶颈之一，其中软腐病危害最为严重，所以尽快开展半夏软腐病的生物防治研究已成为亟待解决的问题。在生物防治方面，植物内生菌是一类潜力巨大、应用前景广阔的资源微生物，关于内生菌作为生防因子的研究很多，并由此开发出一些生防菌剂[5]。近年来，国外已有内生细菌用于马铃薯、水稻、棉花、玉米、甘蓝、白菜、番茄和水果产后病害防治的报道；国内针对马铃薯环腐病、番茄青枯病、辣椒炭疽病等病原菌也进行了内生菌的生防研究[6]，显示了内生菌作为生物农药的良好前景。但内生真菌应用于软腐病防治的研究报道较少。 　　本文主要从半夏中分离内生真菌，进行初步的拮抗筛选及鉴定，为探索内生菌对半夏软腐病的生物防治奠定基础。 　　1 材料与方法 　　1.1 试验材料 　　样品来源：用于内生真菌筛选的样品为采自浙江、山东、四川、江西半夏种植地的135株健康和发病较轻的半夏植株，保存于牛皮纸袋。 　　半夏软腐病原菌：由浙江理工大学生物工程研究所分离保存的胡萝卜果胶杆菌胡萝卜亚种（Pectobacterium carotovorum subsp. carotovorum）SXR1菌株。 　　1.2 试验方法 　　1.2.1 样品处理及消毒 　　将各处理置于28℃培养箱中，7 d后???查发病情况，统计发病率和病情指数。重复3次。 　　1.2.6 18S rDNA的ITS序列分析 　　③核酸序列数据的分析和系统树的构建：将2个菌株ITS序列用NCBI的BLAST进行比对，用邻近法（NJ）进行聚类分析和构建系统发育树，进行系统发育学分析。 　　2 结果与分析 　　2.1 内生真菌分离 　　从浙江、山东、四川和江西的半夏种植地共采集半夏135株，按根、球茎和茎分别进行内生菌的分离，共获真菌分离物76株，其中地上茎分离出11株，球茎42株，根部23株；从浙江采集的半夏样品中分离出38株，山东半夏样品中19株，四川半夏样品中10株，江西半夏样品中9株。 　　2.2 拮抗菌初筛 　　用平板对峙培养法对76个真菌分离物进行拮抗效果筛选，结果筛选出2株拮抗真菌SC6和SC7，抑菌圈直径均在20.7 mm左右，如图1所示。 　　注：图为接种病原菌后培养24 h时拮抗真菌SC6的拮抗效果。拮抗真菌SC7与SC6效果图相仿，仅提供SC6的效果图。下同。 　　图1 内生拮抗菌对半夏软腐病的抑菌效果 　　2.3 拮抗菌复筛 　　以半夏球茎为筛选材料，由图2知，A、B、C均未发病，而D严重发病，说明该2个拮抗菌SC6和SC7不仅对半夏不具有致病力，而且均可有效抑制半夏离体块茎上软腐病的发生，表现出良好的防效，防治效果高达100%。 　　A：CK（阴性对照）；B：拮抗菌；C：拮抗菌+病原菌；D：病原菌（阳性对照） 　　图2 内生拮抗菌对半夏球茎软腐病的抑制效果 　　2.4 拮抗真菌形态特征 　　将内生拮抗真菌SC6和SC7分别接种于PDA平皿中培养，菌落和菌体形态见图3和图4。2个菌的形态均呈白色，初平坦，渐渐表面呈绒状，生长后期菌落中间呈现沙褐色，菌落反面呈黄色；分生孢子梗光滑无色，有隔膜，顶端膨大成半球形泡囊，从泡囊的顶部至2/3处密生小梗，小梗双层，分生孢子串生于小梗顶端，分生孢子头紧密直柱状，分生孢子小而光滑，近球形。经上述形态观察初步鉴定为半知菌亚门丝孢菌纲从梗孢目丛梗孢科曲霉属。 　　2.5 18S rDNA的ITS序列分析 　　对PCR扩增产物采用琼脂糖凝胶电泳进行检测，电泳结果如图5，扩增条带大小约600 bp。 　　M： Marker；1：SC6；2：SC7 　　图5 拮抗真菌SC6 和SC7的18S rDNA的