微阵列第2次课.ppt

第二章 微阵列设计原理 黄仲曦 基础医学院肿瘤研究所 cDNA微阵列示意图 表达微阵列（基因芯片）分类 cDNA微阵列 DNA探针（?100 mer），往往是PCR的产物 用点样法固定在玻璃板上的DNA探针阵列。在标准化和批量化生产方面仍有不易克服的困难。 寡核苷酸微阵列 短的寡核苷酸探针（25 mer左右） 在玻璃等硬质表面上直接合成的寡核苷酸探针阵列。该方法把微电子光刻技术与DNA化学合成技术相结合，可以使基因芯片的探针密度大大提高，减少试剂的用量，实现标准化和批量化大规模生产。 微阵列技术的基本过程 1、芯片制备 目前制备芯片主要以玻璃片或硅片为载体，采用原位合成或点样的方法将寡核苷酸片段或cDNA作为探针按顺序排列在载体上。 2、样品制备 生物样品往往是复杂的生物分子混合体，有时样品的量很小。所以，必须将样品进行提取、扩增，获取其中的蛋白质或DNA、RNA，然后用荧光标记，以提高检测的灵敏度和使用者的安全性。 3、杂交反应 杂交反应是荧光标记的样品与芯片上的探针进行的反应产生一系列信息的过程。选择合适的反应条件能使生物分子间反应处于最佳状况中，减少生物分子之间的错配率。 4、信号检测和结果分析 杂交反应后的芯片上各个反应点的荧光位置、荧光强弱经过芯片扫描仪和相关软件可以分析图像，将荧光转换成数据，即可以获得有关生物信息。 cDNA微阵列设计原理 cDNA微阵列设计原理 微阵列上“印”有大量已知部分序列的cDNA探针，利用分子杂交原理，使同时被比较的标本（用同位素或荧光素标记）与微阵列杂交，通过检测杂交信号强度及数据处理，把他们转化成不同标本中特异基因的丰度，从而全面比较不同标本的基因表达水平的差异。 寡聚核苷酸微阵列设计原理 Affymetrix 基因芯片 思考题 表达微阵列按探针分类？ 微阵列技术的基本过程？ cDNA微阵列设计原理？ Affymetrix基因芯片探针设计原理？ 第三章 微阵列表达值计算 黄仲曦 基础医学院肿瘤研究所 基于模型的寡核苷酸微阵列的表达值计算方法 范例 做21 张HuGeneFL型号的基因芯片检测。 该型号基因芯片含7,129个探针集（超过250,000个探针）。 以其中的6张芯片为例。 统计学模型 样品数量I1 基因表达值数据集：2×I×20（对探针） θi代表某基因在第i个芯片的表达值。 模型假设： 每个探针的信号值随着θi增加而线性增强； 不同探针的增强系数不同； 在同一个探针对，PM信号值比MM大得多。 基因表达值的计算模型一 基因表达值的计算模型二 参数估计 结 果 标准误 思考题 基于模型的寡核苷酸微阵列的表达值计算方法的统计学假设和计算公式是什么？ 基于模型的寡核苷酸微阵列的表达值计算方法的参数估计公式和误差公式是什么？ 探针选择和异常值及污染自动检测 探针选择的必要性 Some probes inevitably hybridize to one or more nontarget genes. Most crosshybridizing genes to have expression patterns different from that of the target gene. Different probes in a probe set cross-hybridize to different nontarget genes. For a nontarget interfering gene k’, the sensitivity indexes Φj(k’) are expected to be small except for one or two probes in the probe set. The mixed response of a probe set to target and nontarget genes suggests that probe selection (in the analysis stage) may enhance the specificity in estimating the expression levels of the target gene θi (k). 过去探针选择标准 The mean and standard deviation of the PM–MM differences of a probe set in one array are computed after excluding the maximum and the minimum. If a difference deviates by more than 3 SD from the mean, a pr